细胞示踪技术研究概述

周陈清 黄 浩

(福建师范大学生命科学学院 福州 350117)

多细胞生物正常生命活动的维持和发展建立在体内各种器官组织中各自包含的种类繁多、数量庞大的细胞之间协调活动的基础上，细胞自胚胎发育开始就不断地迁移和分化，在生命个体活动中扮演着各自重要的角色。示踪各种组织细胞的活动，对于研究体内特定类型细胞的起源及命运、组织器官的发育过程、机体生理机制及疾病的发生和发展都至关重要。通过不同的标记物或采用不同的成像手段，研究者可以对同一实验对象在不同时间点进行实时比较，也可以跟踪同一目标细胞在体内的动态变化。这种方法既可减少实验动物的数量，符合动物伦理要求，又可以使获得的数据更加真实、生动和可靠。目前，最新细胞示踪技术已经能实现对特定单个细胞及其所有后代细胞的分化和发育活动的追踪和观察(即细胞谱系示踪)，为细胞再生研究提供了新思路。细胞示踪技术已被广泛应用于干细胞治疗、基因功能研究、器官移植和新药研发等领域。

细胞示踪技术最早起源于20世纪初。早在1905年，Conklin等利用柄海鞘胚胎早期分裂球着色差异，对分裂球的发育过程进行观察，提出了“胞质决定子”的理论。Mio和Maeda等使用慢速摄影技术实现对活体胚胎的示踪观察。此后，科学家尝试使用多种类型的标记物，通过物理的方式注入到细胞内对其进行标记追踪，并采用多种成像手段进行观察记录。本文就目前主流的细胞示踪技术使用的标记物、标记方式和成像技术三方面的研究进展进行概述。

1 细胞示踪标记物

理想的细胞示踪标记物需满足三个要求： ①标记物能明确标记初始时间点的细胞；②标记物仅保留在原始细胞及其后代中，不会扩散到邻近的细胞中；③标记物足够稳定，在细胞示踪期间对细胞无毒[1]。根据标记物的种类可以分为外源性标记物和内源性标记物。

1.1 外源性标记物 外源性标记的实现比较容易，其主要方法是将标记物通过与细胞膜的吸附、扩散、内吞以及转运等方式，按标准流程简单孵化而导入细胞内。常见的外源性标记成像方式有： ①荧光染料成像。由于荧光染料种类很多，且都是亲脂性的，故能吸附在细胞膜上，使标记细胞产生荧光而被检测到。但是，这种方法容易受到自发荧光的干扰，而且容易淬灭，背景信号较多，信噪比较差。②量子点成像。量子点标记物一般是直径在2～100 nm的、接近圆球形的半导体粒子，具有荧光光谱窄、不易漂移、激发光谱宽、颜色可调、光化学稳定性高以及不易分解等优点。其发光强度是有机荧光染料的20倍，稳定性是荧光染料的100倍，不易被代谢，组织存留时间较长。量子点标记物已经成为活体细胞示踪的良好材料，有较好的发展前景。

1.2 内源性标记物 与外源性标记物相比，内源性标记物通常是具有生物活性的蛋白质，可代谢、无毒、可透过各种屏障。因其基因片段较小，容易整合到大多数细胞基因组中，对宿主细胞的正常结构和功能影响不大，同时又能稳定表达和遗传，不存在稀释问题，有利于较长时间的细胞示踪观察。内源性标记物主要包括荧光素酶、荧光蛋白及β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)3类。

1.2.1 荧光素酶 常用的荧光素酶有北美萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶[2]，其荧光波长分别为540～600 nm和460～540 nm。荧光素酶基因导入细胞后，能表达荧光素酶，通过注射底物就可观察被标记细胞的发光现象，实现细胞示踪。由于荧光素酶催化底物发光不需要激发光，其能量来自于酶的催化反应，发光只发生在活体细胞内，且具有一定组织穿透性，可以避免激发光造成的光噪现象。但是，荧光素酶的缺点是其催化发光容易淬灭，同时底物具有免疫原性，不适用于固定的标本等。

1.2.2 荧光蛋白 荧光蛋白与荧光素酶发光方式不同，它不需要注射底物，其发光原理是较高能量的激发光能使其蛋白构象发生改变而产生荧光。目前发现有30多种不同波长的荧光蛋白，常见的有绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和黄色荧光蛋白等。荧光蛋白由于荧光信号强，便于观察追踪，已经广泛应用于细胞示踪研究中，其中最常用的是细胞毒性最小的绿色荧光蛋白。最近，利用一种重组酶系统(Cre/Loxp)构建的双荧光mT/mG转基因小鼠[3]，因其能够在Cre酶作用下改变荧光颜色，提高细胞在组织内的分辨率而引起研究者的重视。然而，荧光蛋白的局限在于荧光发光必须依赖于激发光，因此其荧光信号易受周围组织干扰。

1.2.3 β-半乳糖苷酶 β-gal是β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的表达产物，因其能催化乳糖水解，当使用β-gal的显色底物(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside， X-Gal)时染色呈蓝色。利用这一特性可以实现观察和检测。但是由于它不能在活体细胞内观察而少采用。

综上所述，内源性标记较外源性标记操作复杂，需要将外源基因导入宿主细胞中，这可能会带来潜在性风险。不同的标记物(外源性的或者内源性的)都有各自的特点，应根据研究目的选择合适的标记物，并且还需要考虑实验动物种类、研究的组织类型以及标记物对细胞本身的影响等因素。

2 细胞示踪标记方式

对于内源性标记物来说，将外源基因导入靶细胞是细胞示踪的关键。依其实现方式的不同可分为单一式标记和复合式标记两大类型。

2.1 单一式标记细胞示踪 常见的单一标记包括转染、转导和基因打靶。

转染(transfection)是指真核细胞导入外源DNA而获得新的遗传标志的过程。主要包括电击法、磷酸钙法、脂质体介导法以及病毒介导法等。但由于转染对细胞伤害较大，可能影响细胞的正常生长发育，且导入的遗传标记在细胞内表达效率和稳定性不容易控制等问题，使得这种方法应用较少。

转导(transduction)是利用腺相关病毒、腺病毒、慢病毒或逆转录病毒等工具将外源基因整合到宿主细胞中。这种源于细菌遗传学的研究手段已经应用于哺乳动物的细胞示踪。目前一种较为成熟的、应用于细胞示踪的RCAS逆转录病毒体系可以实现在体内指定时间和特定部位控制表达标记[4]。与转染质粒相比，逆转录病毒转导方式对细胞毒性小，但是它只能标记有分裂能力的细胞，且有时也会发生表达沉默的现象。

基因打靶技术是以胚胎干细胞技术和同源重组技术为基础的一种定向基因编辑手段，能使修饰后的遗传信息在生物活体遗传并稳定表达。在细胞谱系示踪中应用的位点特异性重组酶(site specific recombinase， SSR)系统就是基因打靶技术发展起来的。SSR主要包括来自酵母的FLP/FRT位点特异性重组系统和来自埃希氏大肠杆菌噬菌体P1的Cre/Loxp重组酶系统[5]，两者都能在特异性位点切割和连接DNA，而Cre/Loxp系统重组效率更高。Joyner等最早将Cre/Loxp系统应用于体内细胞谱系示踪研究，证实了En2阳性细胞在小鼠大脑发育中的重要作用[6]。之后，为了解决特异性控制标记时间的问题，科学家对Cre/Loxp系统进行了改造，即通过雌激素受体的配体(如他莫昔芬tamoxifen)调控Cre入核时间，以实现对基因敲除时间点的控制。Barker等[7]就利用了这一升级后的系统，观察到肠道上皮干细胞在60天内特异性地表达含G蛋白偶联受体的富含亮氨酸重复序列5(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5,Lgr5)基因，最终证明了Lgr5基因为肠道干细胞的标志基因。所以，Cre/Loxp系统的标记方式相比以往的细胞示踪手段，具有良好的靶向性，很大程度上避免了错误标记的问题。此外，Cre/Loxp系统是对基因组进行编辑，能稳定遗传，所有表达过Cre的细胞及其后代的所有细胞都会被永久地标记，这为细胞谱系示踪奠定了基础。目前，Cre/Loxp系统已经广泛应用于细胞示踪研究。

2.2 复合式标记细胞示踪 复合式标记方式比单一标记方式能更准确地指示目的细胞的位置，这引起了研究者的极大兴趣。最早的复合式标记小鼠采用的是基于Cre/Loxp系统建立的Z/AP和Z/EG小鼠，它们能通过LacZ染色阳性或者增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)荧光来追踪被标记的细胞。另一种复合式标记小鼠是双荧光蛋白mT/mG小鼠，在Cre表达的情况下，mT/mG小鼠相应组织或细胞由表达tdTomato的红色荧光转变成表达EGFP的绿色荧光，由于tdTomato和EGFP都具有细胞膜靶向性，因此通过观察激发光条件下不同颜色的荧光就可以区别出未标记和已标记的细胞，从而极大提高了示踪的分辨度。此外，还有一种“Brainbow”多荧光标记系统是应用于斑马鱼的复合式标记系统，能使体内不同细胞显示不同颜色荧光来进行细胞区分和辨识。复合式标记系统以其高分辨度，特别是配合影像学的新进展，将成为今后主要的活体细胞示踪的标记手段。

3 细胞示踪成像系统

细胞活体示踪技术的发展与影像学的发展息息相关。早期细胞示踪研究时多采用直接观察法，通过显微镜直接观察组织细胞的动态变化，借助光学成像对细胞形态进行评估。这种操作的优点是简便迅速，由于不需要对细胞进行任何标记，也就不影响细胞的生长发育，适合研究模式动物的胚胎发育情况。缺点是观察的胚胎必须具有少量透明的细胞，且无法追踪胚胎中具有特定表型的细胞。伴随着复杂的细胞标记物和标记方式的出现，成像技术也逐步得以发展。目前，常用的细胞活体示踪成像方法有： 光学成像、核磁共振成像和核素成像。

3.1 光学成像技术 光学成像技术利用光学仪器直接检测活体细胞活动，得到二维平面图像。光学成像的优点是： 操作简便，敏感度较高，无创、无毒、无放射性，费用相对较低。由于标记物的不同，光学成像可以分为生物自发光成像和激发荧光成像两类。目前的光学成像仪器通过装配离散窄频带滤波器和电子可调滤波器，改进光谱分析的计算机软件算法，引入具有透视能力的高敏感CCD数码相机，已经广泛应用于细胞示踪成像技术。

3.2 核磁共振成像技术 该技术的原理是利用动物组织中氢原子核的核磁共振现象，将所获得的射频信号经计算机处理，重建动物体某一层面的数字图像。核磁共振成像的优点是空间分辨率高、敏感度强，多用于细胞治疗领域；缺点是被测物不能含有磁性物质，而且造影对比剂一般都有少许毒性。

3.3 核素成像技术 核素成像的原理是把放射性药物引入患者的体内，然后在体外检测药物发射的γ射线，通过计算机断层扫描显像和正电子发射断层显像技术，根据检测到的各器官组织放射活性比例，从而确定细胞在体内的分布和定量关系。核素成像技术的优点是由于核素的发光光谱是连续的，可以选择任意波长进行成像，且不需要激发光；同时由于显像技术的高敏感性和特异性，使核素成像的敏感性高于核磁共振成像法。但是它的不足也是很明显的，主要是成像空间分辨率较低，标记物会产生辐射,带来辐射泄漏风险，检测设备也较昂贵等。

近年来，光学成像和其他成像技术相结合形成的多模态分子影像学为细胞示踪研究打开了新的空间。

例如，IVIS sepctrum成像系统和双光子显微镜的配合使用，具有结构性CT成像和功能性光学成像双重功能，既能检测动物体内的生物自发光和激发荧光，还可以结合CT扫描，最终以3D图形显示目的细胞的活动状态。这套系统适用于小动物整体水平的示踪研究，也能较好地显示目的细胞在体内所处的解剖位置，经常被应用于肿瘤发生、发展和治疗的研究。此外，将光学成像的高灵敏度与核磁共振成像的高分辨率相结合，将光学成像与核素成像相结合以克服核素的半衰期短的局限等，都使我们能够更好、更直观地实现细胞示踪。

4 展望

综上所述，细胞示踪特别是新近发展的细胞谱系示踪的研究对阐释细胞及其后代分化、发育和迁移等活动有着重要意义。目前，标记示踪有许多实现方法，但每一种方法都有其优缺点，应根据研究目的不同以及细胞情况或动物实验类型选择合适的示踪方法，并探索多模态标记示踪技术实现优势互补，以达到更好的示踪效果。新的基因编辑技术(如Crispr/Cas9系统)可用来构建各种转基因工程小鼠，为相关研究提供良好的动物模型。先进的光学设备(如双光子显微镜)的使用，使研究者可以在活体内连续地对标记细胞进行实时示踪观察。

随着生命科学研究的深入，更高效的细胞示踪技术将与单细胞基因组学相结合开启细胞生物学和发育生物学研究的新篇章，并对临床疾病机制和细胞治疗研究等产生深远的影响。