被子植物花粉管生长及双受精作用的分子机理

黄紫筠 (首都师范大学生命科学学院 北京 100048)

双受精(double fertilization)是被子植物特有的生殖方式，是区别于裸子植物的重要特征之一。双受精现象是由俄国植物学家纳瓦兴于1898年发现。他以头巾百合和细弱贝母为材料，观察到卵细胞和极核同时分别与花粉管中释放出来的两个精子融合的过程，由此发现了被子植物的两个精子都参与受精。作为植物胚胎学史上的重大里程碑，双受精在生物学上具有重要意义。本文对被子植物双受精作用的分子机理研究进展做一概述，为植物遗传和育种学的相关研究提供基础资料。

1 花粉与柱头识别

双受精作用的第一步是传粉，即雄蕊中花粉借助风力或昆虫的作用落到同一朵花或另一朵花雌蕊柱头上的过程。花粉落在柱头表面后，随即引起一系列复杂的细胞形态变化和生理生化过程的发生，包括花粉黏附、花粉水合、花粉萌发长出花粉管、花粉管在花柱中极性生长并最终进入胚囊，完成双受精。雄蕊花粉与雌蕊柱头的黏附能力决定着受精作用能否顺利发生，而不同物种由于其柱头形态和生理特征的不同又会影响黏附能否成功。湿柱头黏性大，干柱头则借由乳突细胞粘附花粉，花粉黏附后释放外壁蛋白与柱头表面的蛋白相互识别并特异性结合，呈现“认可”的亲和识别反应[1]。研究发现芸苔属植物油菜和甘蓝中先后发现的S位点相关蛋白SLR1和SLG通过与花粉包被的A类蛋白PCP-A结合从而影响花粉的黏附作用[2， 3]。黏附后亲和识别反应随即发生并引起花粉的水合。由于被子植物成熟花粉含水量较低导致其代谢处于被抑制的水平，因此花粉的水合可以让其恢复代谢活性，从而利于花粉管的萌发。近期研究结果显示，B类花粉包被蛋白PCP-B是拟南芥花粉—柱头相互作用水合检查点的关键调控因子，当花粉表面丢失多个PCP-B时，不仅花粉水合作用严重受损，并且水合缺陷还会导致所研究的所有突变体的花粉粘附能力降低和花粉管生长延迟[4]。

2 花粉管萌发与生长

在花粉粒的壁上还有一定数量的萌发孔或萌发沟，花粉在柱头上萌发时花粉管就由萌发孔或沟处向外突出生长，该过程中花粉通过柱头油脂层吸收水分，逐渐萌发出花粉管。同时柱头油脂层渗透出的水分所形成的梯度又引导着花粉管往柱头乳突细胞处生长，最终花粉管突破柱头细胞壁进入花柱的引导组织。花粉管在引导组织中向胚珠生长阶段会受到孢子体雌蕊组织的控制，称为孢子体导向；离开引导组织过后，花粉管在胎座位置出现在假隔膜表面并向着珠柄表面生长，继而转向珠孔生长，直至进入胚囊。该阶段的生长导向受到雌配子体的调控，称为配子体导向[5]。

2.1 花粉管生长的孢子体导向 花粉管生长的孢子体导向主要与雌蕊花柱的引导组织有关。拟南芥ntt突变体由于引导组织正常发育存在困难，花粉管生长缓慢或提前结束，并且在从顶端柱头到基部子房的生长过程中，花粉管的侧向分化更为明显，偏离子房的生长导致育性降低从而影响受精作用。这些实验结果表明，引导组织对于提高被子植物受精效率具有关键作用，特别是与子房临近的引导组织下部能通过自身分化和程序性死亡来促进花粉管的生长[6]。早期研究发现，拟南芥雌配子体在花粉管由顶向基的生长过程中并不会发出信号引导其向胚珠生长，而孢子体组织对花粉管的导向一般认为基于两种截然不同的原理——机械原理和化学原理，它们被认为是解释花粉管在引导组织中定向生长的原因[7]。引导组织细胞分泌产生的引导区胞外基质为花粉管从柱头延伸至胚珠的生长提供机械导向框架。胞外基质主要是由糖蛋白和蛋白多糖组成的大分子网络，花粉管在引导组织中的定向生长是不断与该网络密切接触并受其化学引导控制的过程。1995年，有研究报道烟草特异性阿拉伯半乳糖蛋白TTS由柱头向胚珠方向的糖基化程度逐渐增高，并指出纯化的TTS蛋白是一种对花粉管生长有积极作用的雌蕊组织成分[8]。后续研究也发现了对花粉管向性生长起重要引导作用的其他蛋白，如： 百合柱头的小碱性蛋白质chemocyanin和拟南芥中的同源蛋白plantacyanin均富含半胱氨酸黏附蛋白，它不仅参与花粉管由顶向基的极性生长，同时对花粉管自身的顶端生长也有促进作用。引导组织中的其他小分子物质也在这个过程中发挥重要引导作用，如： γ-氨基丁酸(GBAB)是植物生殖生长过程中的一个重要信号分子，其浓度梯度在引导组织中的紊乱将导致花粉管缠绕成团而结束生长或偏离子房方向继续生长[9]。其他小分子物质如NO、 Ca2+和cAMP等，也与花粉管引导有关。

除了机械和化学导向研究，目前关于花粉管生长的分子机制研究越来越多。2003年《细胞》杂志报道拟南芥中转氨酶(POP2)通过催化作用调控GBAB浓度水平从而控制花粉管的生长[9]。中国农业大学叶德研究组分别于2005年和2011年先后报道了编码果胶甲酯酶同源蛋白(VGD1)的基因和编码木糖基转移酶(MGP4)的基因为花粉管生长所必需。其中MGP4基因参与果胶的生物合成，在花粉管和根系生长中发挥重要作用[10]；VGD1基因在花粉粒和花粉管中特异表达，该基因功能受损使花粉中的果胶甲基酯酶活性降低到野生型的82%，大大延缓了花粉管在引导组织中的生长，导致拟南芥雄性生育力显著下降[11]。

2.2 花粉管生长的配子体导向 花粉管穿过花柱，离开引导组织到达子房，随后向着珠柄和珠孔端区域的生长由雌配子体细胞发出信号进行引导。根据配子体发出的信号是引导花粉管朝着珠柄生长亦或是朝着珠孔生长，配子体导向又被习惯性分为两个阶段： 珠柄引导和珠孔引导。吸引花粉管从胎座至珠柄伸长的信号机制知之甚少，当前研究集中于深度剖析花粉管到达离珠孔约10 μm距离时突然转向珠孔进入胚珠的原因，并取得了重大进展。Tetsuya等[12]用蓝猪耳做实验材料，利用激光切断术分别破坏其卵细胞、助细胞和中央细胞。结果显示： 只有当助细胞被全部杀死时花粉管才无法正常进入胚珠，由此证明是靠近卵细胞的两个助细胞吸引了花粉管，而且单个助细胞就足以产生吸引信号，而两个细胞则增强了这种信号；尽管受精后仍存在一个助细胞，但不会再有花粉管向着胚珠生长，这种吸引的停止可能与阻止多精有关；助细胞中存在一个特殊结构——丝状器，它是由助细胞细胞壁加厚形成的，通过增大接触和分泌面积吸引花粉管进入胚珠。该实验室还发现，助细胞释放的特异性吸引花粉管的物质为一类富含半胱氨酸类防御素小肽(LURES)，通过注射物影响LURES的表达可削弱胚珠对花粉管的吸引能力[13]。研究发现，玉米中的一类只在卵器表达的、包含94个氨基酸的非富含半胱氨酸小肽(ZmEA1)，其在玉米基因遗传改造后表达下调，珠孔对花粉管的近距离吸引也随之有所减弱，从而导致胚珠不育，这表明ZmEA1参与了雌性配子体吸引花粉管所需的短距离信号传递[14]。同年Kasahara等[15]筛选拟南芥在雌性配子体中表达的基因时发现了转录因子家族基因(MYB98)，该基因只在助细胞中表达。转录因子家族基因突变体myb98助细胞中丝状器发育异常，野生型花粉管能沿着珠柄生长但却不能准确定位进入珠孔。AtLURE1小肽被鉴定为拟南芥中引导花粉管进入珠孔的引诱物质，该小肽从助细胞分泌至丝状器，下调表达将影响珠孔引导的精确性[16]。

雌配子体中除了助细胞会发出信号物引导花粉管向着珠孔生长以外，其他细胞也在这个过程中扮演着重要角色。2007年，杨维才研究组发现中央细胞在拟南芥花粉管诱导中起着至关重要的作用： 中央细胞特异表达的转录因子(CCG)突变体胚珠导向有所缺陷，CCG基因正常表达足以恢复胚珠对花粉管的正常吸引[17]。随后他们发现一种与CCG互作的纤维素结合蛋白(CBP1)作为新型转录调控因子参与了花粉管的引导调控[18]。遗传分析表明，拟南芥中珠孔引导有缺陷的配子体突变体如myb98和ccg不能表达富含半胱氨酸的小肽(AtLURE1)。各类研究陆续展现雌配子在花粉管定向生长阶段的吸引作用，但其要发挥导向功能的前提必须是在完全成熟情况下。有研究显示拟南芥解旋酶基因(MAA)突变体胚珠发育迟缓，花粉管仅能沿着珠柄表面生长而不能进入珠孔[19]。

雌配子体发出引导信号过后，花粉管自身需要对这类信号进行识别、接收，并作出反应。2013年瞿礼嘉研究组鉴定了两个在拟南芥花粉管中优先表达的受体样激酶(LIP1/LIP2)，它们通过棕榈酰化作用被固定在花粉管顶端区域的膜上，LIP1和LIP2同时失活导致花粉管引导进入珠孔的功能受损，显著降低了花粉管对AtLURE1小肽的吸引力，该研究结果表明LIP1和LIP2是花粉管受体复合体的重要组成部分，它们能够感知雌配子体发出的AtLURE1信号，从而指导花粉管向着珠孔导向生长，但是因为没有细胞外结构域，所以LIP1和LIP2可能不是感知雌性信号的膜受体。2016年，杨维才等在花粉管中筛选到了可以感知雌性诱导信号分子LURE1的膜表面受体蛋白激酶MDIS1、 MIK1和MIK2，并确定它们均为质膜定位受体样激酶。杨维才等还发现，LURE1小肽通过与这些激酶的细胞外结构域特异性结合启动花粉管的定向胚珠生长，发生上述激酶突变的花粉管对LURE1的感知反应较弱，由此首次揭示了雌雄双方信号识别和激活的分子机制。

3 精子释放与细胞融合

在雌方信号吸引下花粉管进入胚珠，其生长逐渐减慢并停止，通过丝状器进入胚囊中的一个助细胞，并引起该助细胞的程序性死亡降解，随即花粉管爆裂释放运输的两个精细胞完成自身使命，该过程称为花粉管的接收。释放的两个精细胞，一个与胚囊中的卵细胞融合形成二倍体的合子发育成胚，另一个与中央细胞融合起始胚乳发育，至此双受精过程宣告完成。成功受精的关键还取决于花粉管在运输精细胞的过程中自身完整性的保持，只有花粉管破裂的时机和释放精细胞的位点都正确受精才能成功，而破裂和释放过程的发生又需要花粉管与助细胞双方多种分子信号的交流。在雌配子体方面，已经报道了在助细胞中对花粉管接收至关重要的多种成分： 类蛋白受体激酶(FERONIA， FER)在拟南芥助细胞表面和受体激酶NORTIA(NTA)、锚定蛋白LORELEI(LRI)相互作用，与下游的第二信使活性氧(ROS)和Ca2+一起调控助细胞对花粉管的接收效率。fer、nta和lri突变体中这些信号分子的异常表达导致胚珠内的花粉管过度生长和精子释放的失败。此外，一种助细胞分泌的多肽ZmES4也有利于激活花粉管中的K+通道，从而触发玉米花粉管爆裂[20]。在雄配子体方面，三个花粉表达的转录因子MYB的缺失产生了与类蛋白受体激酶突变体fer相同的表型，这些研究结果提示雌雄配子体共同参与了花粉管的爆裂[21]，花粉管到达助细胞之前导致早熟花粉管爆裂的突变也有报道。这些数据表明细胞壁、膜受体信号和离子动力对花粉管的完整性至关重要。花粉管爆裂与释放的精确性是由细胞外信号分子与花粉管表面的受体相互作用控制的，但是这些信号通路的激活机制长时间未被知晓，直至2017年相关研究成果鉴定出拟南芥存在两个相关受体： 蛋白激酶BUPS1、 BUPS2以及它们的多肽配体细胞快速碱化因子RALF4和RALF19，它们均是由花粉管表达并应用于花粉管完整性的维持。BUPS1和BUPS2通过胞外域与类受体激酶ANXUR1/2相互作用，两组受体都与RALF4和RALF19结合。这些受体—配体相互作用与雌性配体细胞快速碱化因子RALF34竞争，RALF34在一定摩尔浓度下会导致花粉管爆裂[22]。

4 结语

被子植物双受精作用中雌雄配子体相互作用的分子机理正被逐步揭示。该过程从花粉黏附识别到精子释放需要众多信号的交流，每一步的异常都可能成为植物体有性生殖繁衍的障碍，由此可见植物体双受精作用的复杂性与精确性。未来研究方向将集中在小肽信号受体鉴定、小肽信号事件发生机制、小肽信号生物学功能及发现新信号事件方面[23]，因此双受精过程完整画面的呈现还有待科研工作者的共同努力。