lncRNA在慢性肝病中的作用与机制研究进展

王志敏，金欢欢，卞勉励，开 钧，杨 祥，邵江娟，张 峰，2，3，郑仕中，2，3

[南京中医药大学1. 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室、2. 江苏省中药功效物质重点实验室、3. 中药品质与效能国家重点实验室(培育)，江苏 南京 210023]

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一组长度>200 nt，且不具有编码蛋白功能的RNA转录本。曾一度被认为与转录本无关，不具备生物学功能[1]。然而，近几年科学家们研究发现，lncRNA参与调控生命活动的每一阶段，在表观遗传、转录、转录后等水平，影响基因的转录与表达，调节多种下游通路，保证机体生命功能的正常发挥。但是，lncRNA的异常表达可能导致体内生物学功能的紊乱，引发疾病，甚至癌症，尤其是肝癌。目前大量研究证实，lncRNA已经成为肝癌研究中一个新的热点。

在研究肝癌的基础上，基础和临床研究人员将对lncRNA的研究扩展到整个慢性肝病上，并对慢性肝病发展的不同时期进行探索。目前，研究发现lncRNA在肝炎、非酒精性脂肪肝、肝纤维化以及肝癌等不同慢性肝病阶段都出现异常表达，其生理机制也逐渐被阐明。本文主要对近几年，lncRNA在慢性肝病不同时期中的研究进展进行归纳与总结，为研究慢性肝病发生、发展机制提供新思路，为寻找慢性肝病治疗新靶点提供新方向。

1 lncRNA的概述与生物学功能

2002年，日本科学家首次提出长链非编码RNA的概念，即长度大于200个核苷酸的非编码RNA转录本[2]，这是lncRNA首次进入人们的视野。随后，斯坦福大学的Rinn等[3]于2007年报道了一条功能性长链非编码RNA (HOTAIR)，通过修饰染色质，参与HOX基因的转录。这一发现说明，lncRNA并非仅仅是编码RNA的“噪音”，其有可能对整个基因的表达起到调控作用，由此，lncRNA开始成为基因研究的热点。研究发现，lncRNA在表观遗传、转录、转录后水平都起到一定作用，并根据lncRNA的生物效应不同，概括为信号、诱饵、指导和支架4种功能[4]。信号功能指的是lncRNA能够整合发育线索，在特定的时间和地点发生转录，因此，lncRNA是标记空间、时间、发育阶段和基因调控表达的信号。诱饵功能是指lncRNA被转录后结合一种蛋白质靶标，并使其失活，但不会发挥任何其他功能，其中，通过与microRNA结合，并调控其靶基因转录与表达的作用被称为microRNA海绵效应，具备这种功能的lncRNA，被称为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA ，ceRNA)。指导功能指的是lncRNA结合RNA结合蛋白，然后指导复合物定位到特定的目标。支架功能指的是lncRNA可同时结合多种效应器配体，将可能具有转录激活或抑制的效应物在时间和空间上汇集在一起。目前，lncRNA的研究已经在乳腺癌、肝癌、肺癌等多个领域开展，已经证实的下游通路也在不断增多，并且彼此形成网络，相信随着对lncRNA多领域、多层次的研究，其生物学功能将进一步完善。

2 lncRNA与慢性肝病

基因芯片和高通量测序技术的发展，使得lncRNA在肝脏方面的研究逐渐深入[5]。H19和XIST是首次在肝脏中鉴定和研究的lncRNA，随后又发现了其他两种新型lncRNA：Meg3和MALAT-1，Meg3已经被证明是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的肿瘤抑制基因，而MALAT-1在HCC发展中具有致癌作用。除此之外，还有大量的lncRNA与肝脏疾病有关，下文根据不同的疾病分类，综合分析lncRNA与慢性肝病的关系。

2.1 慢性肝炎慢性肝炎可由饮酒、病毒感染、服用肝毒性药物等多种原因引起。研究发现，lncRNA与病毒性肝炎关系密切，而病毒性肝炎已成为威胁人类健康的重要因素，其中乙型病毒性肝炎最为常见。目前，注射肝炎疫苗是预防病毒性肝炎的主要方式。Zhao等[6]发现，lnc-HULC在介导肝癌增殖与转移的同时，也介导HBV相关性肝硬化的免疫过程。HULC的过表达，促进调节性T细胞(Treg)的分化，其可能与HULC和p18的相互作用有关，提示靶向lncRNA，或许能够促进肝炎疫苗消灭乙型肝炎病毒。另一方面，乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)是调控乙型肝炎病毒基因复制的关键蛋白，抑制其表达能够准确杀伤肝炎病毒，但注射肝炎疫苗对整合病毒DNA产生HBx没有影响。因此，针对肝炎病毒复制，寻找抑制HBx蛋白表达或生理过程的新靶点是必要的，lncRNA的出现为我们提供了新的思路。Zhang等[7]已证实，lnc-HOTAIR与RNA解旋酶DDX5竞争结合多梳蛋白SUZ12，并加速SUZ12的降解，SUZ12是多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex2，PRC2)的重要亚基，而HBx激活有丝分裂polo样激酶1(polo-like kinase 1，PLK1)介导的SUZ12的活化。表明lnc-HOTAIR可以干扰HBx介导的SUZ12活化，但其是否直接影响HBX的表达还不得而知。因此，lncRNA与病毒性肝炎的关系还不明确更多调控慢性肝炎的lncRNA还有待发现。

2.2 非酒精性脂肪肝由于现代饮食和生活方式的变化，脂肪性肝病在世界范围内普遍存在。肝脏脂质积聚会导致脂肪肝，脂肪肝又包括酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)和非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)。AFLD由过度饮酒导致，目前还没有发现与其有关的lncRNA。导致NAFLD的发病原因众多，包括肥胖、胰岛素抵抗、高脂血症、代谢综合征、动脉粥样硬化等，但其详细的发展机制还不清楚。

有研究人员针对lncRNA，探究NAFLD发展的具体过程与机制。值得注意的是，通过高通量测序分析高能量饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎小型猪长非编码RNA发现：与正常饮食组相比，多种lncRNA差异表达，利用GO和KEGG通路分析发现，其可能调节与非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)密切相关的靶蛋白编码基因，如3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶2(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthetase 2，HMGCS2)、细胞色素 P450 2E1(cytochrome P450 2E1，CYP2E1)和Fos等[8]。除此之外，研究者已经证实多个与脂质代谢相关的lncRNA。Liu等[9]发现，lnc-H19在饮食诱导的脂肪肝中被过表达脂肪酸上调，同时也上调多嘧啶束结合蛋白1(polypyrimidine binding protein 1，PTBP1)。H19与PTBP1相互作用，以促进其与固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein 1c，SREBP1c)mRNA和蛋白的结合，导致稳定性和核转录活性增加。SREBP1c入核，调节脂肪酸合成酶FASN的转录。除H19可以调节SREBP1c外，lnc-MALAT1也可以调节SREBP1c的稳定性，抑制其泛素化降解，但具体机制尚未阐明[10]。另外，Li等[11]发现了一种调节小鼠全身脂肪代谢，并在肝脏富集的长非编码RNA(lnc-LSTR)。lnc-LSTR缺陷通过促进组织甘油三酯(triglycerides，TG)清除率，降低TG水平。

2.3 肝纤维化肝纤维化是由酒精滥用、肝炎病毒以及其他各种病因所致的肝内结缔组织异常增生的过程，其主要特征是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白的产生和沉积增加。在肝脏中，影响纤维化产生的最主要细胞是肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)，在纤维化过程中，HSC活化并伴随大量ɑ平滑肌动蛋白(ɑ-smooth actin，ɑ-SMA)、I型胶原α1(type Ⅰ collagen α1，ColIa1)的产生[12]。一般来说，lncRNA通过调控基因表达，影响HSC的活化与增殖，介导肝纤维化过程。

许多lncRNA 受TGF-β调控，大量研究证实，TGF-β的过表达促进HSC活化。有文献[13]指出，在定义的共3 692个lncRNA基因座中(代表人类HSC中检测到的所有lncRNA位点)，139个lncRNA基因座被TGF-β信号诱导，而242个lncRNA基因座被抑制[14]。多项lncRNA的研究也指明了这一点。例如：He等[14]发现，当用TGF-β1处理LX2细胞时，lnc-MEG3以时间和剂量依赖性方式下调。而过表达的MEG3促进HSC凋亡、抑制HSC增殖，下调ɑ-SMA和ColIa1 mRNA和蛋白表达，影响纤维化相关基因mRNA表达，发挥抗纤维化作用。在非酒精性肝纤维化中，有研究证实，C-X-C基序趋化因子配体5(C-X-C motif chemokine ligand 5，CXCL5)为lnc-MALAT1在肝细胞中的基因靶标[15]。过去研究已经证实，肝纤维化和活化的HSC中CXCL5 mRNA和蛋白质水平增加，因此，lnc-MALAT1或许以CXCL5依赖型的方式参与肝纤维化过程。以上结果说明，lncRNA受纤维化因子调控的同时，也调控纤维化因子，而肝纤维化的产生是多种lncRNA异常表达的共同结果。

lncRNA在调节肝纤维化的过程中，涉及多条通路。Zhang等[16]发现，lnc-LFAR1活化TGF-β和 Notch信号通路，且提出TGF-β1/Smad2,3/lnc-LFAR1通路可以提供TGF-β与Notch通路的新型连接方式。而抑制lnc-MEG3的表达能够增强p53蛋白表达，过多的p53转位至线粒体外膜，与抗或促凋亡Bcl-2家族成员相互作用，诱导线粒体外膜透化，导致细胞色素C释放和半胱天冬酶活化，表明lnc-MEG3调控p53依赖的线粒体凋亡途径。另外，lncRNA也参与调控与胆汁酸代谢相关的通路。胆汁酸代谢异常，导致高水平的胆汁酸损害胆管上皮细胞，并提高胆管内压力，使肝细胞暴露于高浓度胆汁酸，造成巨噬细胞浸润，肝细胞死亡，诱发胆汁淤积性肝纤维化疾病。有研究发现[17]，lnc-H19的过表达加重了胆汁淤积性肝纤维化。在机制上，H19通过与E盒结合锌指蛋白(E box binds zinc finger protein，ZEB1)相互作用，阻断ZEB1与上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)启动子结合，ZEB1抑制EpCAM启动子活性和基因转录。也有文章指出，H19与小型异源二聚体(small heterodimer partner，SHP)有关，而SHP受法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)调控，维持肝细胞胆汁酸平衡。

2.4 肝癌HCC是我国十大最高发的恶性肿瘤之一，是由多种危险因素引起的慢性肝病发展而来。目前，lncRNA在肝癌中的作用已经成为研究的热点，研究发现，lncRNA影响肝癌细胞的各种生理活动，包括肝癌细胞的增殖、自噬和肿瘤转移与侵袭。最近发现，lncRNA对肝癌干细胞的自我更新有一定的影响。

2.4.1肝癌干细胞的自我更新 肝癌干细胞是肝癌组织中存在的少数具有干细胞特征的恶性肿瘤细胞，数量多且分裂速度快。肝癌干细胞的快速分裂可能是导致肝癌复发和耐药的主要原因。过去已经发现，lncRNA在肝癌组织干细胞中发挥关键作用，因此，lncRNA可能成为治疗肝癌干细胞自我更新的新靶点。

lncRNA多通过表观遗传修饰的方式，影响相关通路的传导，而Wnt/β-catenin是调控肝癌干细胞自我更新和致瘤性的主要信号通路。多项研究发现，lncRNA对肝癌干细胞的调控与β-catenin信号相关，例如：lnc-DANCR可能与CTNNB1的3'-UTR竞争性结合，以阻断miR-214和miR-320a介导的CTNNB1抑制，发挥ceRNA的作用，增加β-catenin蛋白表达，促进肝癌干细胞在HCC中的扩增[18]；另有研究发现，lnc-β-Catm募集组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶，促进β-catenin甲基化[19]。除影响Wnt信号通路外，lncRNA还影响JAK2/STAT3信号通路。最近研究发现，lnc-DILC在肝癌干细胞中低表达，通过抑制JAK2/STAT3信号通路，抑制肝癌干细胞的扩增。继续研究上游通路发现，lnc-DILC与转录因子NF-κB竞争结合IL-6的启动子，抑制IL-6的转录，从而调控JAK2/STAT3信号通路[20]。

2.4.2肝癌细胞 目前，已在肝癌中发现大量1ncRNA异常表达，且这些1ncRNA通过调节肝癌细胞增殖、自噬、凋亡、迁移与侵袭，起到致癌或抑癌基因的作用。在肝细胞增殖方面，已有研究发现，lnc-ANRIL在HCC组织中上调，而lnc-ANRIL表达降低可抑制HCC细胞的增殖、转移和侵袭，并诱导凋亡[21]。Ma等[22]在此基础上通过一系列的实验证实，lnc-ANRIL作为miR-122-5p的分子海绵，敲低后，抑制HCC细胞生长、转移和侵袭。lncRNA 还具有分子支架作用。有研究发现，lnc-HULC是YB-1蛋白与细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的分子支架。YB-1是平滑失活的信使核糖核蛋白颗粒(messenger ribonucleoprotein granules，mRNPs)的主要组成部分，维持mRNAs静止状态。事实上，HULC可以促进YB-1蛋白的磷酸化，从而导致YB-1从其结合的mRNA中释放。因此，静止的致癌基因mRNA的翻译将被激活，包括细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E1、MMP-3等，调控肝癌细胞增殖，促进癌细胞侵袭与转移[23]。在肝癌细胞凋亡方面，Chen等[24]发现，lnc-MEG3以p53、内质网应激两种方式，介导肝癌细胞凋亡。事实上，MEG3的异位表达增加p53以及内质网应激相关蛋白78-ku葡萄糖调节蛋白(ER stress-related protein 78-ku glucose regulatory protein，GRP78)、肌醇需求酶1(inositol demand enzyme 1，IRE1)、RNA依赖蛋白激酶样ER激酶(RNA-dependent protein kinase-like ER kinase ，PERK)、激活转录因子6(activation of transcription factor 6，ATF6)等的表达，但具体机制不明。在肝癌细胞自噬方面，Xiong等[25]发现，lnc-HULC可以通过稳定Sirt1蛋白，诱导自噬。Sirt1已被证实参与调控Atg5、Atg7、Atg8、Beclin I、FoxO1、p53等关键蛋白，诱导自噬。其主要通过阻断miR-6825-5p、miR-6845-5p 和miR-6886-3p对USP200的抑制作用，导致与Sirt1形成的复合物增加，减少Sirt1泛素化降解。但荧光素酶报告基因结果表明，HULC并不是作为ceRNA减弱3种microRNA对USP200的抑制作用，具体机制还有待探究。

3 结语与展望

综上所述，lncRNA 在肝癌的研究中较为成熟，如lnc-HULC、MALAT1、HOTAIR等涉及肝癌发生的多条通路，介导多种细胞生理过程，而在肝炎、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、肝纤维化方面研究还不具体，虽然通过测序已经发现与多个lncRNA相关，但并没有对其鉴定和机制研究。从已有的文献可以看出，不同的lncRNA或许能够介导相同的通路，例如多个lncRNA介导Wnt/β-catenin通路，调控肝癌干细胞自我更新；在NAFLD中，lnc-H19与lnc-MALAT1共同介导SREBP1c的稳定性。说明不同lncRNA之间存在彼此串联的可能性，这或许能成为研究lncRNA的新思路。另一方面，lncRNA 与microRNA关系十分密切，尤其是在肝癌的研究中，提出了多条lncRNA-microRNA轴。ceRNA和海绵效应的提出，也证实了这一点。不过，microRNA也可以反过来影响lncRNA的转录，两者的相互作用还有待于进一步深入研究。总之，lncRNA的出现为我们研究肝脏疾病、开发治疗药物，提供了新策略和新方法。虽然，lncRNA与肝脏疾病关系的研究已经取得了一定的成绩，但具体的机制不清晰和新问题的不断提出，都对我们的研究提出了更高的要求。