Toll样受体7介导抗流感病毒免疫反应研究进展

史玉聪，许华冲，陈孝银

(暨南大学 中医学院，广东 广州510632)

Toll样受体是机体识别病原体的主要固有免疫受体[1-2]。不同类型的TLRs(Toll-like receptors，TLRs)识别不同的病原体相关分子模式(PAMP)[3]，在抗病毒中发挥不同的作用。最新研究表明外来抗原的持续作用使Toll样受体脱敏，避免和缓解自身免疫疾病[4]。到目前发现TLR家族共包括13名成员，即TLR1～TLR13。其在体内有各自的生理特征及表达位置，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6表达于免疫细胞表面；TLR3、TLR7、TLR8和TLR9表达于细胞核内。其中TLR7可调节巨噬细胞的自噬从而介导流感病毒的进展外，也可通过MyD88信号依赖型通路调节病毒诱导的相关免疫反应，从而参与调控流感病毒侵袭人体的发生发展过程。

1 TLR7的来源

1988年Hashimoto等在研究果蝇胚胎发育过程中发现一个决定背腹侧分化的基因，将其命名为Toll基因[5]。1994年，Nomuria等在哺乳动物中发现一种蛋白，这种蛋白胞膜外结构域富含亮氨酸的重复序列，与果蝇Toll蛋白结构相似[6]。Taguchi等克隆并定位编码这种蛋白的基因，也就是TLR1。TLR1成为人类发现的第一个果蝇Toll蛋白的同源物[7]。Lemaitre等发现在果蝇对真菌感染的免疫中Toll起着重要作用，从而确立了Toll的免疫学意义[8]。一年后，另一个哺乳动物Toll样受体(TLR4)的同源物被证明诱导炎症反应相关基因的表达[9]。Du等于2000年在人类基因组数据库中，找到3个与MyD88高度同源序列，经过克隆得到3个新的人类TLRs基因，分别命名为TLR7、TLR8和TLR9[10]。从此展开了对TLR7的一系列研究。

TLR7是Toll样受体家族中的重要成员之一，基因存在于人类X染色体上第30065号基因，编码的成熟蛋白肽链含1022个氨基酸[11]，位于巨噬细胞、B淋巴细胞、浆细胞样树突状细胞、呼吸道神经细胞的内体表面等。TLR7表达于细胞的内溶酶体中[12]，是一种能够识别病毒单链RNA(ssRNA)的受体和某些小分子抗病毒化合物。TLR7蛋白属于I型跨膜蛋白，主要有胞外区，跨膜区，胞内区三部分组成。胞外区富含亮氨酸重复序列(LRR)，主要功能是识别相应配体，胞内区是一段高度保守序列，其功能主要是与下游接头分子形成复合物，将信息传递到核内[13]。

2 TLR7介导的MyD88依赖性信号通路

TLR7识别病毒相关ssRNA病毒感染后，通过激活骨髓分化因子88(MyD88)招募下游的信号事件，NF-κB是TLR7介导的MyD88依赖性信号通路中重要的信号分子，TLR7信号通路活化后，NF-κB抑制物IKB降解，解除对NF-κB的抑制作用，游离的NF-κB转位入核，调控细胞粘附分子、细胞因子、趋化因子、免疫受体、酶等发挥免疫学效应[14]。Wei等证实在H5N1感染期间，TLR7的MyD88依赖性途径参与了鹅的流感病毒先天免疫应答的早期阶段[15]。

近年来对中药抗流感的研究较多，其中关于TLR7介导的MyD88依赖性信号通路的研究显示，该通路通过减轻炎症反应缓解病情。黄芪多糖通过TLR4/7-MyD88-NFκB信号转导通路降低肺组织的炎性反应，发挥抗流感病毒感染的作用。治疗和预给药的方式均能缓解流感病毒诱导的肺炎性病理损伤，发挥抗流感病毒感染的作用[16]。银翘散、清热透表方能通过抑制TLR7信号通路的激活，下调下游因子MyD88，来降低炎性细胞因子分泌，进而减轻肺部病理损伤[17-18]。梓醇抑制大鼠肺泡巨噬细胞通过下调TLR7、MyD88、NF-κB和PLA2，可减轻流感相关的过度免疫反应[19]。汉黄芩素对流感病毒感染肺泡巨噬细胞中NF-κB核转位抑制作用，降低NF-κB蛋白的产生，进而降低炎症物质的产生，减轻肺损伤[20]。

3 与TLR7相关的抗流感病毒免疫反应中的作用机制

TLR7在诱导抗流感病毒感染的先天性和适应性免疫反应中发挥重要作用，然而TLR7在抗流感病毒免疫反应中的作用机制及TLR7缺失对机体的具体影响机制尚不清楚。Lemaitre等研究表明天冬酰胺内肽酶(AEP)激活TLR7控制的抗甲型流感病毒(AIV)的免疫应答[21]。AEP活性对TLR7加工是至关重要的，TLR7需要AEP的蛋白水解切割以产生能够发信号的C端片段。AEP缺陷小鼠的抗IAV免疫应答减弱，表现为细胞相关抗原交叉表达水平和IAV诱导的TLR7依赖性CD8+T细胞产生水平的降低，以及炎症减轻。Jeisy-Scott等研究表明在流感病毒感染的体液免疫应答中，TLR7信号传导是通过骨髓来源的抑制细胞(MDSC)的募集来实现的，MDSC在TLR7基因敲除小鼠的肺中积累比在野生型C57Bl/6小鼠中更多，并且促进细胞因子表达，与野生型小鼠的CD4+T细胞相比，TLR7基因敲除小鼠Th2细胞因子产生增加，导致Th2偏倚反应[22]。表明TLR7在小鼠IAV感染过程中可以调节MDSC的积累，在小鼠缺失TLR7的情况下增加了MDSC积累和对Th2的偏倚反应。Blasius等认为TLR7和TLR9的激活通过募集IRAK(IL-1受体[IL-1R]相关的激酶)介导促炎细胞因子，进而诱导MyD88的募集，在浆细胞样树突状细胞(pDC)中存在另外的途径，TLR7和TLR9通过MyD88直接通过转录因子IRF7诱导大量的IFN表达[23]。Pang等的研究表明CD8+T细胞对正常滴度的IAV反应的激活并不依赖于TLR7和RIG-I下游的组合信号，而是依赖于炎症小体IL-1β和IL-1R/MyD88。流感病毒感染细胞后，通过TLR7与RIG-I信号通路介导的炎症反应，招募了大量易被IAV感染的靶细胞到呼吸道，从而增强呼吸道内的病毒载量[24]。Hipp等认为弗林样蛋白转化酶在人类TLR7分子的加工和累积过程中发挥了重要作用，它可减少TLR7依赖性自身免疫病的发生，并作为免疫病理的可能靶标[25]。Kaminski等得到类似的结论认为，pDC可能通过来自TLR7的信号有助于保护肺免受IAV感染[26]。有研究认为病毒可激活pDC的TLR7和TLR3信号通路产生β-干扰素，进而减轻肠道炎症，启动机体抗病毒及抗炎的免疫应答过程[27]。

4 TLR7与流感病毒引起的炎症风暴

流感病毒引起人呼吸道感染，导致普遍流行性，发病率和死亡率普遍较高，但也因类型不同而各异。与甲型H1N1亚型和乙型流感病毒相比，甲型H3N2亚型流感病毒有着更高的发病率和致死率[28]。感染H9N2亚型流感病毒的患者通常仅有轻微的上呼吸道感染症状，甚至不出现任何症状，H5N1亚型流感病毒感染患者症状重、起病急，大都会在发病初期出现高热、咳嗽、气急、头痛、肌肉酸痛和全身不适等症状[29]。机体感染流感病毒后“细胞因子”效应所诱导的适度的免疫反应是有益的，但是如果诱导过度演变成“细胞因子风暴”，就会转变为病理性免疫反应，造成肺组织的炎性损伤和自身细胞的破坏。在感染H5N1禽流感病毒的患者体内观察到的细胞因子风暴现象被普遍认为是促炎性细胞因子的过度或失控释放[30]。多项研究表明流感病毒引起的炎症风暴是通过TLR7途径实现的。To等首次证明了IAV可以通过激活小鼠肺泡巨噬细胞中的TLR7信号通路，促进NADPH氧化酶2(NOX2)氧化爆发，引起急性肺损伤[31]。有研究认为MALT1在肺泡巨噬细胞中有调节TLR7激动剂和IAV诱导的MMP-9免疫应答作用，MALT1在TLR7刺激后介导巨噬细胞中CYLD的减少，肺泡巨噬细胞中MMP-9的产生是通过NF-κB实现的，而MALT1缺陷可降低IAV感染的严重程度，这说明了MALT1在调节肺泡巨噬细胞MMP-9的产生中发挥重要作用，其存在加剧了流感的严重程度[32]。Makni-Maalej等认为，TLR7/8激动剂CL097通过介导人嗜中性粒细胞选择性位点中的p47phox的磷酸化，导致NADPH氧化酶的超活化，合并激活p38MAPK、ERK1/2通路进而产生过量的过氧化物产生引起炎症风暴[33]。

5 TLR7佐剂研发的流感疫苗

接种疫苗是预防和控制流感病毒感染最经济有效的方法之一。开发病毒保守表位的新抗原，而不是病毒血凝素HA高度可变的抗原区域，以及增强疫苗抗原性和诱导保护性免疫反应的佐剂，是一条更有指导意义的思路[34-37]。近年来，根据TLR7介导的流感病毒免疫反应机制，通过激活TLR7信号通路来刺激先天免疫应答成为研究趋势。Zhang等研发的ILR7激动剂咪喹莫特联合流感疫苗可以促进和增强BALB/c小鼠抗IAV pdm09的体液免疫应答[14]。陈婷婷等利用自主研发的新型TLRs7小分子激动剂SZU-101(T7)与流感病毒偶联形成Flu-T7疫苗可以有效地增强H1N1流感病毒灭活疫苗的免疫效果，并且对小鼠低毒性，SZU-101可以作为H1N1流感病毒灭活疫苗的一种安全有效的佐剂[38]。Goff等合成TLR4和TLR7配体结合的重组流感病毒血凝素作为一种有效的佐剂，可诱导快速和持久的免疫力，对抗流感病毒的不同亚型起作用[39]。Fujita等开发的一种针对TLR7/8的自我佐剂肽疫苗的新型高效疫苗，是基于TLR7/8配体结构，合成一系列氨基酸6-咪唑并喹啉基-正亮氨酸的疫苗，其在Lys的ε-NH2基团上构建了与TLR7/8激动剂药效基团一样的咪唑并喹啉结构。将IAV M2e抗原与TLR7/8激动剂氨基酸混合或共价缀合作用于小鼠，在不存在其他佐剂的情况下可诱导M2e特异性抗体的产生[9]。与TLR7激动剂相比，TLRs7/8激动剂小分子的特点使得它们代谢快速、起效窗口期较短，往往造成药效不一致。而在新型TLRs7/8激动剂的开发中，发现采用偶联型TLRs7/8合成的蛋白-TLRs7/8复合体疫苗则具有显著的免疫保护效果[40]。Jeisy-Scott等研究表明，TLR7基因敲除小鼠的生发中心形成后，其抗体分泌细胞和循环流感病毒特异性抗体水平显著降低，在受到流感病毒攻击时未能形成保护性免疫记忆[41]。

6 展望

流感病毒在全球流行，找到有效的防制措施迫不及待。TLR7信号传导依赖于核内体酸化传导[12]，并通过识别核内体或溶酶体中的ssRNA，导致炎症和调节性细胞因子的分泌，GU序列存在于病毒以及宿主内源性RNA中，所以TLR7不能区分“外源的”和“自身的”RNA，除非存在GU频率或RNA碱基修饰的差异[42]。某些合成化合物：咪唑奎诺酮和雷西莫特是TLR7和TLR8的配体，然而有研究表明鸟苷类似物也能活化TLR7[43]。RNA被普遍存在的细胞外核酶(RNases)快速降解，以至于极少的自体ssRNA到达抗原呈递细胞，因此缺乏TLR7识别的特异性ssRNA基因序列。针对TLR7的这些缺点，有研究试图基于寡核苷酸改进RNA的核酸酶稳定性，以此增强TLR7和/或TLR8的免疫调节活性[44]。Steed等研究表明类黄酮经肠道菌-梭状芽胞杆菌代谢的产物脱氨基酪氨酸，并不能阻止流感病毒的传染，但可以阻止免疫系统对肺部组织的伤害，提供了一种治疗流感的新思路[45]。有研究表明肠道菌群失调加重流感病毒引起的组织病理改变，通过激活LPS/TLR4通路，从而上调小鼠肺组织流感病毒所致的炎性因子应答水平[46]。另外，肠道厌氧菌失调小鼠体内存在明显的细胞因子网络失衡，肺组织内Th1、Th2、Th17及Treg细胞因子参与菌群失调小鼠流感病毒感染后引起的肺组织的免疫病理损伤[47]。我们的前期研究认为流感病毒感染能引起小鼠肠道菌群失调，导致机体TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6和NF-κB等的mRNA表达水平的变化，并发现相关中草药可通过调节肠道菌群恢复机体的正常免疫应答以达到抗病毒作用[48-51]。当受到流感病毒感染时，肠道菌群失调会抑制TLR7信号通路活化，益生菌治疗后，可以恢复TLR7信号通路的正常表达水平，从而发挥抗流感病毒的作用。因此，从肠道菌群入手结合TLR7信号通路探讨抗流感病毒的相关机制，或可为防治流感提供新的有效途径。