中药植物雌激素补肾活血化瘀

孙雷 (山东中医药大学中医学院，山东 济南 250355)

〔关键词〕 补肾；中药；植物雌激素；活血化瘀；内皮细胞；血管平滑肌；雌激素受体；G蛋白耦联的雌激素受体

肾气亏虚是血瘀的重要原因。血瘀多见于中老年人，而肾气虚亦随年龄加重。补肾活血化瘀法多用于中医临床治疗。许多中药含有植物雌激素，这类物质具有雌激素样活性，能够模拟雌激素功能，并可以规避雌激素副作用。近年来，药理学研究发现，中药植物雌激素可通过其补肾作用而活血化瘀。

1 中药植物雌激素的补肾作用

雌激素有补肾的功效，其通过雌激素受体(ER)而发挥作用。经典的ER有细胞内的核受体ER-α及ER-β，并且，二者也见于细胞膜中。近年来，发现了新型的G蛋白耦联雌激素受体(GPER)〔1～5〕；另外，雌激素与离子通道蛋白的相互结合也已见诸报道〔6〕。植物雌激素广泛存在于中药中，可以模拟雌激素的功效，从而起到一定的补肾功效。中药植物雌激素可见于补虚药、活血化瘀药、清热药、解表药、利水渗湿药、收涩药及温里药等。从分子结构分析，中药植物雌激素有黄酮类、木脂素类、香豆素类、萜类、甾体类及其他类(如二苯乙烯、真菌源的中药雌激素、环肽类、酚类)〔7〕。中药植物雌激素作为雌激素的结构类似物，可与雌激素的各类受体相作用，发挥补肾功效。

2 中药植物雌激素补肾活血化瘀

雌激素表现中医学的补肾功效，而雌激素在血管系统中的保健治疗作用〔8,9〕已逐渐得到认可。研究显示，中药植物雌激素对心血管系统有类似于雌激素的作用〔10〕。中药植物雌激素可模拟雌激素，发挥血管保护作用，表现一定的补肾活血化瘀功效。

2.1依赖于ER-α及ER-β的活血化瘀

2.1.1增强血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性与表达 血管内皮细胞合成的一氧化氮(NO)有舒张血管、抑制平滑肌增殖、抑制血小板凝集、抑制白细胞黏附血管内皮、抗促动脉粥样硬化分子氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)的形成等作用。雌激素作用于ER，通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等，提高eNOS的表达与活性水平。中药植物雌激素可发挥类似作用。

2.1.1.1增强eNOS的活性 人参皂苷Rg3快速(5 min)增强ECV304人内皮细胞中eNOS的磷酸化水平。ER拮抗剂ICI182,780、PI3K抑制剂LY294002阻断eNOS的磷酸化〔11〕。黄柏苷增强ECV304细胞的eNOS磷酸化，并增强Akt磷酸化，此二者的磷酸化被ER拮抗剂ICI182,780减弱，也为ER-α的siRNA或ER-β的siRNA所减弱，提示ER-α与ER-β都参与该过程，且贡献相差不大〔12〕。对于苯肾上腺素预收缩的雄性大鼠主动脉环，Rg3表现舒张作用，而ICI182,780、LY294002可将Rg3的舒张作用阻断〔11〕。人参皂苷Rg3与黄柏苷的作用机制是有差异的：在黄柏苷激活的信号通路中，AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)是PI3K的上游激酶；在人参皂苷Rg3激活ER后，AMPK与PI3K处在不同的通路中。

在内皮细胞EA.hy926中，葛根素〔13〕、白桦脂酸〔14〕同样快速诱导eNOS蛋白磷酸化，而ER的拮抗可减弱葛根素诱导的磷酸化、抑制白桦脂酸诱导的磷酸化。同时，PI3K的抑制可减弱二者诱导的磷酸化。人参皂苷Rg3、葛根素、白桦脂酸与黄柏苷通过ER激活PI3K/Akt途径，诱导eNOS磷酸化的能力不同，这体现在ICI-182,780对eNOS磷酸化的抑制程度有别。在8～10周龄大鼠的肠系膜上动脉环中，三七皂苷 Ft1作用于ER而增强eNOS磷酸化。经Ft1诱导而舒张时，动脉环的Akt和细胞外信号调节激酶(ERK)1/2活化，引起eNOS发生磷酸化；ER-β的抑制剂PHTPP削减此三者的磷酸化水平。可见，介导Ft1功能的是ER-β〔15〕。

2.1.1.2增强eNOS的表达 中药植物雌激素可以诱导eNOS的表达。eNOS磷酸化是非基因的“快速”反应，而eNOS表达的增加需要相对较长的时间才可观察到。人参皂苷Rg3对ECV304人内皮细胞eNOS磷酸化水平的增强在5 min内发生，而对eNOS表达的增强则在3～24 h观察到〔12〕。丹参酮ⅡA可诱导大鼠心脏微血管内皮细胞NO合成升高，而此作用被ER拮抗剂ICI182,780所抑制。就eNOS的表达而言，在30 min到12 h的时段中，经10 μmol/L丹参酮ⅡA诱导，eNOS mRNA 的丰度升高60%～70%。eNOS表达的增加为ICI-182,780完全抑制，故依赖于ER〔16〕。芒柄花黄素加强乙酰胆碱对5-羟色胺预收缩大鼠肠系膜动脉的舒张时，血管中eNOS mRNA丰度提高，并且，免疫荧光染色显示了内皮细胞中eNOS蛋白质水平相应地升高，而ICI182,780、ERK1/2的抑制剂U0126、c-jun氨基末端激酶(JNK)的抑制剂SP600125可抑制这些变化〔17〕。经24 h的诱导，丹参隐酮或汉黄芩素提高了EA.hy926细胞NO的合成，此作用可为ER-α的特异拮抗剂甲基哌啶吡唑(MPP)所阻断。丹参隐酮、汉黄芩素诱导的eNOS表达增强也被观察到。丹参隐酮、汉黄芩素还可诱导ER-α的表达升高〔18〕。

2.1.2舒张血管平滑肌 内皮细胞合成的NO进入血管平滑肌，激活游离的鸟苷酸环化酶，催化环鸟苷酸(cGMP)的生成，从而起到舒张血管作用。除此之外，膜结合的鸟苷酸环化酶亦可被中药植物雌激素激活。雌二醇、白藜芦醇均可分别激活人冠状动脉平滑肌细胞的膜结合鸟苷酸环化酶-A，增加cGMP的生成，从而起到舒张血管的作用。此作用为ICI182,780减弱。白藜芦醇的作用大于雌二醇，而且，ICI182,780未能完全抑制白藜芦醇的作用，这说明白藜芦醇激活膜结合鸟酸环化酶-A的作用与ER有关，但不完全依赖于ER〔19〕。其实，白藜芦醇对心血管系统有多种保健作用，其作用机制是多方面的：雌激素样活性是其中之一〔20,21〕。

因0.1 μmol/L、1.0 μmol/L染料木素或大豆苷元可增加人脐静脉内皮细胞(HUVEC)环氧合酶(COX)-2 mRNA与蛋白质水平，前列环素的生成得以增加，血管平滑肌舒张。ICI182,780的预处理可降低这两种植物雌激素的作用。不过，在更高的浓度下，染料木素与大豆苷元则无此作用〔22〕。

2.1.3保护血管平滑肌 在大鼠平滑肌细胞中，报告基因分析显示杜鹃素具有雌激素样活性，且此活性被ICI182,780所阻断，但不受ER-α特异性抑制剂MPP影响。结合受体竞争性结合试验，杜鹃素被证明是ER-β的激活剂。通过活化ER-β，杜鹃素可抑制5%胎牛血清(FBS)诱导的大鼠胸主动脉平滑肌增殖(DNA合成)；ER-β拮抗剂PHTPP能消除杜鹃素的此抑制作用〔23〕。人参皂苷Rb1有效抑制胎牛血清诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖，而ICI182,780几乎完全消除 Rb1的抑制效果。当ER-β的表达因siRNA的敲减而降低时，Rb1对血管平滑肌细胞增殖的抑制效果相应地出现消减〔24〕。

去甲二氢愈创木酚(NDGA)减弱血管紧张素(Ang)Ⅱ诱发的血管平滑肌细胞增殖，而ER-α的敲减(siRNA技术)或它莫昔芬可逆转NDGA的作用。NDGA抗血管平滑肌细胞增殖的分子作用(被ER-α敲减或它莫昔芬逆转)有：肝激酶(LKB)表达及磷酸化水平的增加，AMPK的磷酸化增加，P21、P27、P53表达的增加，增殖细胞核抗原(PCNA)表达的减少等。除此之外，其他两个发现是，其一，NDGA诱导ER-α表达增加，这可以进一步加强NDGA的雌激素样活性；其二，将LBK的siRNA引入细胞后，ER-α的表达水平甚至降低到本底水平以下，这提示ER-α与LBK间存在双向互动关系〔25〕。

葛根素平抑血管平滑肌细胞向成骨细胞的分化，这有赖于ER/PI3K/Akt信号途径，与雌激素样活性有关。向分离自小鼠主动脉钙化血管平滑肌细胞(CVSMC)加入葛根素，Akt磷酸化快速出现，并在15 min左右达到峰值，而后下降。另外，经葛根素处理48 h，碱性磷酸酶活性被抑制。在ICI182,780预处理的情况下，葛根素相关的碱性磷酸酶活性变化与Akt磷酸化几乎消失〔26〕。7β-羟基胆固醇诱发大鼠血管平滑肌细胞中DNA的片段化与含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3的活性增强，而山柰酚的预处理使得DNA的片段化与caspase-3的活性减弱。ICI182,780 (1 μmol/L)能够逆转山柰酚对caspase-3活性的抑制，并可去除山柰酚对DNA片段化的作用〔27〕。对于取自3月龄SD大鼠降主动脉的血管平滑肌细胞，柚皮素有抑制其迁移的作用；该作用为ER-β的特异性抑制剂所阻断。而且，柚皮素的这一作用未表现与大鼠性别的相关性〔28〕。在血管炎症诱导因素脂多糖(LPS)的刺激下，A5r7平滑肌细胞的NO合成增强、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)表达增加；而以依赖ER-β的方式(受ER-β特异性抑制)，丹参隐酮或汉黄芩素能够降低iNOS及NO升高的幅度。同时，ER-β的表达也因LPS升高，并由丹参隐酮或汉黄芩素的作用而回调〔18〕。

如上所述，植物雌激素阻止血管病理过程中iNOS的表达，防止NO的负面作用。有研究〔29〕发现，植物雌激素提高血管平滑肌iNOS的活性，引起NO合成增加，从而降低血管平滑肌的增殖。在分离自大鼠动脉降支的血管平滑肌细胞中，白藜芦醇不改变iNOS的蛋白表达，但提升iNOS的活性，使NO生成增多，以抑制细胞的增殖。白藜芦醇通过提高NOS激活的辅因子四氢生物蝶蛉(BH4)的水平及BH4合成的限速酶GIP环化水解酶-Ⅰ(GTCPH)表达提升iNOS活性。白藜芦醇的作用与激活ER密切相关，因为ICI182,780大幅消减细胞增殖、iNOS活性、NO生成、BH4的水平及GTCPH表达。

2.1.4保护血管内皮 白藜芦醇提高NO合成，能够减轻血管损伤小鼠中新内膜的增生；而在血管损伤的ER-α-/-小鼠中，白藜芦醇对NO的生成无影响，减轻新内膜增生的作用很小。如此差别的原因有三。其一，就NOS活性的本底水平而言，ER-α-/-小鼠已经远低于野生型小鼠：提示了ER在NO生成中的地位。其二，在白藜芦醇诱导下，就eNOS和iNOS的蛋白水平的提高而言，野生型小鼠的升高胜于ER-α-/-小鼠。其三，白藜芦醇显著增加野生型小鼠动脉组织中的BH4浓度和BH4合成的限速酶GTP环化水解酶-1(GCH-1)的mRNA水平，但对ER-α-/-小鼠没有作用〔30〕。

在体外平行平板流室模拟血管层流剪切的条件下，白藜芦醇诱导男性主动脉内皮细胞(HAEC)增殖和损伤修复，增强ERK的磷酸化；而当ER-α的表达因siRNA敲减而降低 (减少约70.1%)时，白藜芦醇的作用不再有。不过，白藜芦醇的这些作用与eNOS未见明显的相关性〔31〕。

当晚期糖基化终产物(AGE)损伤HUVEC内皮细胞，导致ERK1/2磷酸化、核因子(NF)-κB磷酸化及核定位增加时，毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮的衍生物毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(CG)对其有逆转作用，而该逆转作用又为ICI182,780所阻断。对于AGE刺激HUVEC而引起的炎症分子高表达，毛蕊异黄酮能逆转细胞间黏附分子(ICAM)-1、晚期糖基化终产物受体(RAGE)的过度表达，CG能下调单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、白细胞介素(IL)-6的过度表达；ICI182,780对毛蕊异黄酮、CG起到拮抗作用。另外，毛蕊异黄酮可增加ER-α的表达，ICI182，780则能阻止ER-α的表达增加〔32，33〕。

染料木素、大豆苷元能够保护HUVEC，阻止因过氧化氢(H2O2)而出现的HUVEC凋亡及HUVEC增殖抑制，而ICI182,780可消除染料木素、大豆苷元的保护作用。染料木素还有诱导ER-β高表达的作用，而在ICI182,780的拮抗下，ER-β的表达不再被染料木素诱导增高。可见，染料木素、大豆苷元提升内皮细胞ER-β的表达，并作用于ER-β而防止过氧化物诱导的细胞损伤〔34〕。在雄性大鼠外伤性出血模型中，白藜芦醇降低血管超氧化物的产生。早于白藜芦醇30 min注射ICI182,780，该保护作用消失。模型大鼠的肺损伤、主动脉的NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、gp91phox、NADPH氧化酶(NOX)1、NOX4与血红素加氧酶(HO)-1 mRNA表达的增加、血浆谷草转氨酶(AST)及谷丙转氨酶(ALT)水平的升高，均因白藜芦醇的作用得以回复，而ICI182,780的拮抗则破坏白藜芦醇的作用〔35〕。

绞股蓝皂苷(GP-17)可保护人脐静脉内皮细胞，减少Ox-LDL诱发的损伤。其一，GP-17可一定程度地回调因Ox-LDL而降低的ER-α表达。其二，GP-17 可提高因Ox-LDL而降低的Akt磷酸化。其三，GP-17可增强Ox-LDL对HO-1及NF-E2相关因子(Nrf)2表达的诱导。其四，GP-17可提高因Ox-LDL而降低的抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)与过氧化氢酶(CAT)的活性，降低因Ox-LDL而升高的丙二醛(MDA)。其五，GP-17可纠正由Ox-LDL引起的Bcl-2表达下降、Bax表达升高及caspase-3的裂解增强。这些保护作用可为ICI182,780所消减〔36〕。丹参酮ⅡA给予去卵巢的apoE-/-动脉硬化雌性小鼠后，雌鼠血清中SOD增加,MDA减少，NF-κB、激活子蛋白(AP)-1、可溶性细胞间黏附分子(sICAM)-1及E-选择素(selectin)水平下降，血管ERK1/2的磷酸化水平降低。这些变化因ER拮抗剂 ICI182,780而逆转〔37〕。

2.1.5抗血小板凝集 对于静息的血小板及胶原激活的血小板，丹参酮ⅡA能够调节淀粉样前体蛋白(APP)的裂解方式，从而更多产生可溶性APP(sAPP)α肽，而减少与动脉硬化密切相关的Aβ肽的生成。ER拮抗剂ICI182,780、ER-α特异拮抗剂MPP或PI3K抑制剂LY294002能够阻断丹参酮ⅡA的上述效果；在MPP拮抗ER-α的作用存在时，丹参酮ⅡA对PI3K活性及其下游信号分子Akt磷酸化的上调作用减弱，说明丹参酮ⅡA激活ER-α/PI3K/Akt信号途径，实现对APP裂解的调节〔38〕。

根据Polini等〔39〕的研究，在大鼠动脉条的存在下，染料木素能够抗腺苷二磷酸(ADP)诱导的血小板凝集；以ICI182,780预处理动脉条，染料木素的抗凝集作用被破坏，提示染料木素作用于动脉条的ER而发挥抗血小板凝集作用。另外，如前所述，染料木素、大豆苷元依赖于ER诱导内皮细胞COX-2表达，促进前列环素生成〔22〕。由此可见，染料木素抗血小板凝集的作用可能有两方面：染料木素依赖膜ER的“快速”作用，提高NO的生成、前列环素(PGI2)的合成，降低凝血噁烷的生成〔39〕：染料木素依赖ER调节基因表达，合成更多的COX-2〔22〕。

2.1.6血管再生与重塑 通过成骨细胞，薯蓣皂苷元间接诱导内皮细胞增殖。在体外实验中，薯蓣皂苷元提高小鼠MC3T3-E1培养细胞的血管内皮生长因子(VEGF)-A表达，从而，经薯蓣皂苷元诱导后的MC3T3-E1细胞培养基得以促进人脐带内皮细胞增殖。薯蓣皂苷元的诱导有赖于ER的作用(为ICI182,780所抑制)，通过激酶src、PI3K/Akt和P38，激活低氧诱导因子(HIF)-1α而实现〔40〕。

通过ER-α/Rho激酶(ROCK)-Ⅱ信号途径，芒柄花素诱导HUVEC的迁移及应力纤维的形成：这可被ER-α的siRNA或ICI182,780减弱。芒柄花素诱导的ER-α与ROCK-Ⅱ结合也被ICI182,780所破坏。在ER-α的表达被siRNA敲减后，芒柄花素诱导的基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9表达降低，芒柄花素诱导的肌球蛋白磷酸酶靶亚基(MYPT)1、LIM激酶(LIMK)1、丝切蛋白(cofilin)及肌球蛋白轻链(MLC)2的磷酸化降低。在转基因的斑马鱼模型之肠下血管区域，芒柄花素(50 μmol/L)增加芽体生成和内皮细胞增殖。ICI182,780对芽体生成有一定的抑制作用〔41〕。毛蕊异黄酮促进斑马鱼肠下血管内皮细胞增殖，也促进体外培养的人脐静脉内皮细胞增殖。在促进内皮细胞增殖时，毛蕊异黄酮提高了内皮细胞中ERK1/2的磷酸化水平。对于毛蕊异黄酮的诱导作用，ICI182,780可消除ERK1/2的磷酸化，而部分减少HUVEC的增殖〔42〕。

如上所述，通过特异性抑制或敲除、敲减等技术，可以将中药植物雌激素的活血化瘀作用与ER的活性相联系。近年来，随着GPER研究的进展，中药植物雌激素补肾活血化瘀的内容得以更加丰富。

2.2中药植物雌激素补肾活血化瘀中的GPER 中药植物雌激素作用于GPER而实现的活血化瘀作用不为ICI182,780所抑制,而且，有研究显示，ICI182,780可以活化GPER的作用(有种属特性)〔43〕。现多以G1特异性激活GPER，而以G15、G36为GPER的特异性抑制剂。

与G1的作用机制相类似，原儿茶醛(PCA)通过GPER，改善内皮细胞功能。PCA可提高内皮细胞环腺苷酸(cAMP)水平，减少活性氧，降低由肿瘤坏死因子(TNF)-α诱发的CD-40、血管细胞黏附分子(VCAM)-1、ICAM-1、HIF-1α高表达及NF-κB、P38的磷酸化。在球囊损伤的动脉中，PCA增强再内皮化。同时，PCA还可诱导GPER表达加强。G15表现与PCA、G1相反的作用〔44〕。GPER活化后，反式激活表皮生长因子受体(EGFR)，通过src，Akt、ERK途径，磷酸化eNOS。Rowlands等〔45〕研究雌马酚诱导的人脐静脉内皮细胞eNOS磷酸化，分别以百日咳毒素(PTX)、AG-1478、PP2对G蛋白、EGFR、src进行抑制，观察到Akt、ERK、eNOS的磷酸化被阻断或减弱；Rowlands等〔45〕由此认为，雌马酚的作用是通过GPER实现的。TNF-α诱导eNOS及MMP9的表达，成为内皮细胞的损伤因素。在内皮细胞EAhy926中，芹菜素对二者表达的阻断与其雌激素样活性密切相关。芹菜素的此功能既可被ICI182,780逆转，又因PTX而消减。TNF-α增强蛋白激酶B(PKB)活性而诱导eNOS及MMP9表达增加，芹菜素则降低了TNF-α诱导的PKB磷酸化，而ICI182,780或PTX均有效地消除芹菜素的此作用。ICI182,780对芹菜素作用的逆转说明了ER的参与；而且，PTX的抑制作用说明了GPER的参与〔46〕。不过，Gi有参与ER的信号传递的可能〔47〕；芹菜素并非雌激素，也不能排除芹菜素激活ER及GPER之外的受体而激活Gi/o。若如此，PTX的抑制作用或不能明确GPER参与了芹菜素的功能。

染料木素与GPER有相对较高的亲和力(相对亲和力约为雌二醇的13%)〔48〕，作用于GPER的可能性较大。染料木素可加强A23187舒张自发性高血压大鼠主动脉环的作用，染料木素的作用因G蛋白(Gi/G0)、ER-α或表皮生长因子受体的抑制而消减〔49〕。由此分析，ER-α(研究人员认为可能为ER-46)参与了此过程，GPER也有可能参与其中，GPER与ER间或存在协作关系〔50〕。与分离自正常大鼠的肺动脉相比较，从缺氧14 d大鼠分离得到的肺动脉在经苯肾上腺素收缩后，对卡巴胆碱的舒张反应受损。17β-雌二醇、染料木素或大豆苷元均可恢复此舒张反应性，并且，三者的作用同样被NOS抑制剂阻断。ICI182,780又对三者的作用均无影响〔51〕。那么，雌二醇的此作用不依赖ER，很有可能是依赖于GPER；染料木素、大豆苷元的作用机制或是类同的。与此相似的研究发现有，在乙酰胆碱诱导苯肾上腺素预收缩的高血压模型大鼠血管环舒张时，17β-雌二醇、染料木素或大豆苷元也以不受ICI182,780抑制的方式，增强血管舒张〔52〕。

白藜芦醇诱导猪视网膜小动脉的舒张，有赖于血管内皮合成的NO的作用及不依赖血管内皮的平滑肌自身舒张，而平滑肌的自身舒张因大电导Ca2+激活K+通道的阻断而被抑制〔53〕。后者与G-1激活GPER而舒张冠状动脉平滑肌的机制相似〔54〕。雌激素不止作用于熟知的ER，很多的离子通道蛋白可以与雌激素结合〔6〕。可以推测，通过激活这些雌激素“新受体”，雌激素、中药植物雌激素或者也可发挥补肾活血化瘀的功效。探讨中药雌激素的雌激素样活性、雌激素“新受体”与活血化瘀间的联系，研究成果可期。

气为血之帅，中药植物雌激素通过补肾而活血化瘀，提示中药植物雌激素在瘀血证相关疾病中的治疗作用〔55〕，从而补肾活血化瘀，降低循环系统的外周阻力。中药植物雌激素可模拟雌激素的作用，实现补肾活血化瘀的功能，其机制的研究为在中医理论指导下的新型中药开发提供了可能。同时，中药植物雌激素的补肾活血化瘀作用或可为减缓衰老，养生保健提供新的思路。