哺乳动物雷帕霉素靶蛋白与自噬通路在阿尔茨海默病中的研究进展

常艳芳，胡为民

山西医科大学第二医院神经内科，太原 030001

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)作为细胞生存和代谢的关键调节剂，影响神经元的存活、分化、形态发生和可塑性。其活性受到各种细胞内和细胞外因素的调节。自噬由比利时生物化学家Christian de Duve在1963年提出(来自希腊语“自我吞噬”)，是一种细胞内自我降解的过程，负责细胞组分的系统降解和再循环，例如将错误折叠、多余的蛋白质和受损的细胞器降解并重新利用。mTOR复合物1(mTOR complex 1，mTORC1)是mTOR的复合物，营养因子缺乏或低细胞能量水平时可以诱导自噬，而氨基酸等营养因子可以激活mTORC1，这表明自噬诱导和mTORC1激活紧密联系。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的主要表现是学习记忆能力丧失和认知功能障碍，晚期出现严重痴呆。AD是全球老年人中最常见的痴呆类型，据估计，全世界有2600万人患有AD，到2050年，患有这种疾病的人数可达1亿。然而，临床上还没有任何一种有效的方法能治愈或有效阻止该病的发生和发展。AD患者脑内的典型病理特征为：细胞外β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉积形成老年斑、细胞内Tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结及突触和神经元的丢失[1]。大量证据表明，mTOR、自噬和AD病理过程密切相关，且mTOR通路可以通过自噬途径间接调节Aβ和Tau蛋白的病理变化，这为AD的防治提供了新的思路。本文就mTOR、自噬通路和AD研究情况以及靶向此通路的潜在AD治疗药物进行综述，旨在为AD的治疗及病因研究提供参考。

mTOR组成及其信号通路

mTOR概述雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)最初是在酿酒酵母中观察到的，在酵母中TOR1和TOR2基因可以编码高度同源的Tor1和Tor2两种蛋白[2]。而在哺乳动物中也发现了结构和功能保守的TOR，称为mTOR。mTOR是由2549个氨基酸组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，mTOR的羧基末端与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的催化区域具有高度同源性，因此属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族[3]。mTOR在细胞生长、增殖、代谢、蛋白质合成以及自噬中起着核心作用。

mTOR组成mTOR存在于两种蛋白复合物中：mTORC1和mTORC2[4- 6]。mTORC1和mTORC2两种复合物中共同的蛋白有：mTOR催化亚基、mLST8、Deptor、Tti1和Tel2，mTORC1特有的蛋白是Raptor和PRAS40，mTORC2特有的蛋白是Rictor、mSin1和Protor。雷帕霉素本身是一种来源于吸水链霉菌的大环内酯类抗生素，可抑制TOR和mTOR的活性[7]。雷帕霉素通过结合FK506结合蛋白阻断mTORC1的活性[8]。Raptor是mTORC1的标志性成分，是调节底物识别和蛋白质组装的支架蛋白，可以激活mTORC1下游蛋白如p70S6Ks、4EBPs和STAT3[9]。Raptor通过与雷帕霉素竞争结合FRB结构域激活mTORC1。PRAS40和Deptor是mTORC1的负调控因子，当mTORC1被激活时，PRAS40和Deptor被直接磷酸化和抑制[10]。mTORC2含有对雷帕霉素不敏感的mTOR伴侣(Rictor)，最初认为mTORC2对雷帕霉素不敏感，但后续研究表明延长作用时间mTORC2也可以被雷帕霉素抑制。

mTOR信号通路mTORC1主要调节细胞生长、凋亡、能量代谢和细胞自噬，mTORC2主要与细胞骨架重组和细胞存活有关，目前有关自噬、神经退行性疾病的研究主要集中在mTORC1。各种细胞外信号(如胰岛素、表皮生长因子)可以激活各自的酪氨酸激酶受体并传导下游信号，如PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)通路。激活的AKT和ERK灭活下游的结节性硬化复合体(tuberous sclerosis complex，TSC)2，而TSC2与TSC1、TBC1D7组成TSC。TSC可以抑制下游的Rheb，而Rheb直接激活mTORC1[11]。因此，TSC对Rheb的抑制间接抑制mTORC1的活性[12]。TSC也可以被其他蛋白激酶磷酸化，以此阻止TSC2被细胞外信号抑制。例如，低细胞能量状态(如葡萄糖减少、低AMP/ATP比值状态)下腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)被激活[13]，继而激活TSC并抵消生长因子对mTOR的影响。Wnt信号通路在哺乳动物神经系统发育过程中也非常关键，Wnt信号通路在神经祖细胞中的繁殖和分化过程中发挥重要作用。在Wnt信号刺激下，GSK3β被活化，从而通过激活TSC控制mTORC1信号传导。然而，TSC并不是mTOR信号通路中唯一的控制节点，一些调节TSC2的激酶也直接调节mTORC1的活性。例如，AKT可以通过磷酸化并失活mTORC1的内源性抑制剂PRAS40间接激活mTORC1。S6K1和4EBP1是mTORC1最重要的两种下游底物，mTORC1通过调节S6K1和4EBP1的磷酸化水平影响蛋白质合成与降解、细胞凋亡、核糖体合成、血管生成等从而调节细胞生长、增殖和维持代谢稳态。

自噬信号通路

自噬概述及其信号通路通常所说的自噬，即大自噬，是一种主要的胞质内蛋白降解途径，由自噬体的双膜囊泡包裹细胞质内容物并递送至溶酶体以完成降解。除此之外还有微自噬和分子伴侣介导的自噬，这两种方式中底物直接被转移到溶酶体中而没有囊泡运输。大自噬是最主要的自噬形式，故将在本综述中详述(后文将大自噬简称为自噬)。当细胞受到外界环境的刺激时，各种囊泡开始融合，囊泡的来源可以是质膜、内质网、高尔基体和线粒体等。这些囊泡聚结形成一个扁平的膜囊：吞噬泡。多个吞噬泡相互融合，形成杯状双层膜结构，当该结构的两个边缘聚集并融合时，该双层膜围绕错误折叠的蛋白质、异常细胞器(线粒体、过氧化物酶体和内质网)并形成闭合性空泡，然后与溶酶体融合，形成自噬体，最后溶酶体的水解酶降解自噬体的内层及其包含的内容物。

关键的自噬调节剂通常，在自体吞噬过程中涉及两种泛素样偶联反应，这两种体系维持吞噬体的扩展。首先，Atg12与Atg5共轭后，Atg16L1与偶联物Atg12-Atg5结合形成一个对吞噬细胞成熟至关重要的复合物：Atg5-Atg12-Atg16L1复合物[14]。第2种反应发生在LC3(在酵母菌中为Atg8)，其对于自噬溶酶体的形成是必需的。Atg4切割LC3获得胞质LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺偶联，形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ定位于自噬体膜，它是哺乳动物细胞中最重要的自噬标志物。Atg5-Atg12-Atg16L1复合物与前自噬体膜相关联，通过协助招募LC3延长它们的伸长。随着吞噬细胞扩大并接近闭合，Atg5-Atg12-Atg16L1复合物从外膜解离，而LC3-Ⅱ仍与完成的自噬体结合。除此之外，mAtg9是核心Atg蛋白中唯一确定的多次跨膜蛋白，吞噬细胞的延伸也由mAtg9辅助。

ULK1是哺乳动物自噬泡形成所必需的一种蛋白质。ULK1激酶活性缺失时LC3-Ⅱ不能形成，阻碍自噬过程。ULK1复合物由ULK1、Atg13、FIP200和Atg101组成，受营养因子、生长因子和细胞能量水平(如AMP/ATP升高)一系列磷酸化过程的调控。例如，当氨基酸和葡萄糖缺乏时，AMPK被激活并直接磷酸化ULK1的Ser317和Ser77位点，促进自噬泡的形成，从而激活自噬[15]。另一方面，在氨基酸和生长因子充足时，mTORC1与ULK1复合物结合并磷酸化Atg13和ULK1(在Ser757处)抑制吞噬细胞形成[16]。PI3K复合物由Vps34、Vps15、Beclin1和Atg14蛋白组成，膜泡形成后，ULK1复合物从由细胞质转移至内质网，并增强PI3K复合物的活性，随后可产生磷脂酰肌醇- 3磷酸酯，促进其他效应蛋白与自噬体膜结合，启动膜泡成核反应，介导前自噬体的形成[17]。

mTOR对自噬的调控

首先在酵母和果蝇细胞中得到证实，抑制mTORC1可以诱导自噬。在哺乳动物细胞mTORC1如何调节自噬的机制也相继被阐明。3组独立实验证明mTORC1通过磷酸化包括自噬相关基因13(Atg13)和ULK1在内的复杂成分抑制自噬[18- 20]。Atg13和FIP200是ULK1激酶复合物的重要亚基，抑制mTORC1则导致ULK1激酶活性增加，然后ULK1磷酸化Atg13和FIP200两种因子。在酵母中，TORC1通过磷酸化Atg13并破坏Atg1(哺乳动物ULK1同系物)和Atg13的相互作用抑制自噬启动激酶Atg1，在哺乳动物细胞中，mTORC1磷酸化ULK1的Ser758位点，阻碍AMPK对ULK1的磷酸化[21]。因此，ULK1引发的自噬是由mTORC1和AMPK相互调节的，以响应细胞营养素和能量水平的动态变化。mTORC1则可以通过抑制自噬/Beclin1调节因子1(AMBRA1)的磷酸化影响ULK1的稳定性[22]。还有另外一种mTOR介导的自噬抑制机制，AMPK和mTORC1对Vps34复合物的调节，其活性对自噬体形成至关重要。Atg14L相关的Vps34复合物也参与自噬调节，Vps34形成多种复合物，并在细胞囊泡运输和自噬诱导中起关键作用。在营养物质缺乏时，mTORC1通过磷酸化Atg14L抑制Vps34，而AMPK通过磷酸化Beclin1激活Vps34复合物[23- 24]。

mTORC1还通过调节转录因子EB(transcription factor EB，TFEB)的定位在转录水平调节自噬，TFEB是溶酶体和自噬基因的主要转录调节因子。在受营养和磷酸化作用的调节下，TFEB在细胞质与细胞核中穿梭并影响其转录活性[25]。尽管其他激酶也可以磷酸化TFEB，但已经显示mTORC1直接磷酸化TFEB的Ser142和Ser211位点并阻止TFEB入核，从而影响TFEB对溶酶体和自噬基因的表达。总之，mTORC1通过抑制ULK1和Vps34复合物的活性、磷酸化TFEB以阻止溶酶体和自噬基因的整体表达来抑制自噬，从而协调合成代谢和分解代谢以满足细胞生长的需要。

尚未完全了解mTORC2活性是如何被调控的。然而，有人提出胰岛素/PI3K信号通过促进mTORC2与核糖体的相互作用激活mTORC2，随后mTORC2磷酸化AKT，可导致AKT/mTORC1信号轴的激活。因此，mTORC2可通过激活mTORC1间接抑制自噬。需要进一步的研究来确定mTORC2是否可以直接调节自噬。

mTOR、自噬在AD中的作用

AD的两个典型病理学特征是Aβ聚集形成的细胞外高密度老年斑和Tau蛋白过度磷酸化形成的细胞内神经原纤维缠结。Aβ由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)通过连续的酶促反应切割形成，并且被转运到细胞外空间，Aβ的过量产生或清除障碍会导致其聚集形成老年斑，阻碍蛋白酶体功能并扰乱神经元的功能。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，通过与微管结合，维持细胞骨架的稳定性并促进细胞组分的轴突运输。在正常人体内，稳定的微管可正常高效地介导自噬体向溶酶体运输，保证自噬功能的正常发挥。AD患者脑内Tau蛋白异常过度磷酸化并聚集形成神经原纤维缠结，从而导致细胞骨架异常及细胞死亡，产生神经毒性。另一方面，由于正常的Tau蛋白减少，导致微管溃变，使轴浆运输中止或紊乱，导致轴突变性，神经元死亡。Aβ聚集后可以诱导Tau蛋白过度磷酸化并形成神经元纤维缠结。目前尚不能确定Tau蛋白磷酸化是AD病理改变的始发环节还是继发于Aβ异常。老年斑和神经元纤维缠结是导致痴呆的两个主要病因。老年斑广泛分布于整个大脑皮层，海马和海马周围则较少。随着痴呆的加重，原始的弥散斑最终成为淀粉样蛋白核心的成熟老年斑。神经元纤维缠结数量与密度将不断增加，在杏仁核、前脑基液核和脑干蓝斑和中缝大核也会逐步出现。目前在临床上，AD很难治愈，常见药物包括胆碱能药物、改善脑循环或脑代谢的药物、神经保护药物、抗氧化剂、中药等，国内外的相关研究正处于探索积累阶段。

研究表明，mTOR信号通路与AD的两种主要病理过程(Aβ积聚和Tau蛋白过度磷酸化)密切相关。研究表明，Aβ的积聚加剧mTOR信号传导，而减少mTOR信号则可降低Aβ水平，可见mTOR信号和Aβ之间互相影响[26]。在AD患者脑中，mTOR及下游靶标4EBP1的磷酸化水平发生了改变，并且与磷酸化Tau蛋白呈正相关[27]。在原代海马神经元的实验中证实，mTOR调节Tau蛋白的局部翻译[28]。

一些研究表明激活mTOR信号阻止了AD病理过程。AD动物模型中，mTOR信号传导的缺失损害神经元突触可塑性，此过程可以通过激活mTOR来恢复[29]。mTOR信号的激活可以控制海马神经元中的树突状蛋白质合成[30]。然而，相关实验表明抑制mTOR更有成效，这由mTOR控制自噬信号通路来实现。在3xTg-AD小鼠模型中，mTOR途径是Aβ发挥其毒性的途径之一，支持减少AD中的mTOR信号传导可能是有效治疗AD的观点[31]。在AD的小鼠模型中，皮质Aβ的清除涉及抑制mTOR信号和增强自噬水平，以防止记忆障碍[32]。增加mTOR活性导致Tau蛋白的病理进展，而减少mTOR活性则可以改善Tau病理学变化[33]。来自体外和体内AD模型的实验显示mTOR信号传导的异常增加可能导致Tau蛋白过度磷酸化[34]。

自噬途径有助于清除在神经退行性疾病发展过程中受损的蛋白质聚集体和细胞器，正常情况下，含有Aβ和Tau的液泡在自噬体与溶酶体融合后被降解。然而，在病理状态下，不正常的自噬活动使自噬体成熟缺陷并导致自噬体在神经元中大量积累。在AD动物模型和AD人脑中，均观察到神经元中自噬体和自噬溶酶体的聚集，提示存在自噬产生和清除的异常。在小鼠中，神经细胞中Atg5或Atg7缺乏导致神经元中自噬体的积累，最终造成神经元变性[35]。Beclin1是Vsp34复合物的一部分，作为诱导自噬的一个重要蛋白，在AD患者中减少并且可能最早导致自噬功能的失调[36]。在原代神经元中，用蛋白酶体或自噬抑制剂阻断蛋白质降解途径显著增加了Tau蛋白异常磷酸化，相反，增强自噬或蛋白酶体途径明显减少Tau蛋白异常磷酸化，证实蛋白质降解途径在Tau蛋白中的重要作用[37]。在生理和病理条件下，自噬-溶酶体和泛素-蛋白体酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)是参与Tau蛋白代谢的两大途径[38]。过去UPS一直被认为是降解Tau蛋白的关键途径，最近已经证实，细胞自噬参与过表达Tau和异常磷酸化Tau的降解，降低磷酸化Tau寡聚体水平，而对内源性Tau无明显影响；自噬抑制能增加Tau的细胞毒性[33，39]。

然而，自噬在AD中的作用具有两面性。在AD早期，由突变、蛋白质损伤和聚集诱发的自噬激活可以作为代偿机制起到保护作用；如果这种状态持续存在，或者再合并溶酶体功能异常，就会逐渐形成神经元萎缩、神经突变性和细胞死亡等病理改变，故自噬的平衡非常重要[40]。自噬不仅影响细胞内Aβ的清除，自噬体也是Aβ产生的场所。在病理状态下，AD早期患者脑内神经元产生的Aβ可抑制mTOR，自噬激活后自噬体增多，有利于清除多余的Aβ。在AD患者及AD模型小鼠脑内，由于大量自噬体不能及时被降解，大量的自噬泡及各种不成熟自噬泡的异常聚集，而集聚的自噬体中富含APP、Aβ及β-分泌酶和γ-分泌酶复合体，因此增多的自噬体也成为Aβ产生的场所[41]。在最近的研究中，通过对AD神经元中Aβ如何导致自噬障碍提供了一些新的机制：与轴突的逆向转运相关[42]。因此，随着AD的进一步发展，自噬被激活，但是由于轴突运输障碍或溶酶体的降解功能缺陷等因素导致自噬流不通畅，大量自噬体堆积，一方面细胞内Aβ清除减少，另一方面Aβ产生增加，游离的Aβ增加达到一定浓度时，就会聚集并在细胞外沉积则形成老年斑，从而产生细胞毒性，并进一步阻止自噬流的进行。

在AD中，mTOR信号被过度激活后使自噬途径被阻断，而使得Aβ过度聚集和Tau蛋白的磷酸化。靶向Aβ和Tau蛋白治疗应该被认为是对抗AD的重要治疗方法，调控mTOR和自噬通路信号分子的平衡对AD的治疗显示出良好前景。

靶向自噬和mTOR通路的AD治疗药物

经mTOR通路的自噬诱导途径

雷帕霉素：雷帕霉素是一种FDA许可的抗生素类药物，最初作为免疫抑制剂用于抑制器官移植后的免疫排斥反应。动物实验发现，在3xTg-AD转基因小鼠中，雷帕霉素作为mTORC1的抑制剂诱导自噬，提高可溶性Aβ水平、提升记忆力水平；进一步的AD动物模型显示，雷帕霉素可通过激活自噬改善Aβ和Tau病理学[26]。然而，雷帕霉素的长期治疗却不可取，因为影响对核糖体生物功能和蛋白质转运的调控，出现伤口愈合减缓和免疫抑制等不良反应。

西罗莫司：西罗莫司是一种新发现的雷帕霉素类似物，在AD小鼠模型中，可通过增强自噬提高Aβ和高磷酸化Tau蛋白的清除效率，改善记忆功能。西罗莫司可以抑制mTOR诱导自噬的形成。有研究表明只有在AD早期，给予西罗莫司诱导自噬才具有治疗意义[43]。但是长期使用西罗莫司的患者，会出现伤口愈合缓慢和免疫抑制等不良反应。

其他：Latrepirdine可以刺激mTOR和Atg5依赖性自噬，并降低小鼠大脑细胞内APP代谢物(包括Aβ肽)的含量[44]。最近的研究显示，在AD患者中，Latrepirdine对痴呆相关行为有轻微改善且没有不良反应[45]。RSVA314、RSVA405是两种白藜芦醇类似物，Vingtdeux等[46]的实验表明，RSVA314、RSVA405均可通过激活AMPK通路抑制mTOR的活性，进而促进自噬、提高Aβ降解效率、治疗AD。

不经mTOR通路的自噬诱导途径

GTM- 1：GTM- 1是一种近几年新发现的自噬诱导剂，其AD治疗作用已被越来越多的实验所证实。GTM- 1通过促进自噬体-溶酶体融合诱导自噬、拮抗Aβ寡聚体神经毒性。最近的研究表明，GTM- 1通过不依赖于mTOR通络的自噬诱导途径缓解AD症状，且GTM- 1可能取代雷帕霉素治疗，因为其有效且毒性较小，特别是对雷帕霉素治疗敏感的AD患者[47]。

卡马西平：Zhang等[48]研究发现抗癫痫药物丙戊酸钠和卡马西平可通过抑制肌醇的合成而诱导自噬起到抑制Aβ聚集和降低其细胞毒性的作用。最近研究表明，卡马西平诱导的自噬能抑制AD小鼠模型脑内Aβ含量的增加并改善小鼠记忆功能，且这种自噬诱导作用并不通过mTOR通路控制[47]。

其他影响自噬通路的药物：SMER28是一种小分子的自噬增强剂，通过Atg5激活自噬并降低Aβ的水平[49]，具有治疗AD的潜力。临床试验表明锂具有治疗AD的潜力，这种效应可能与自噬诱导相关。在对AD临床研究的荟萃分析中，与安慰剂组相比，锂显著改善认知能力下降且未显示明显的不良反应[50]。据报道，AD小鼠模型中，用烟酰胺(维生素B3/PP)进行长期治疗可以减少Aβ和Tau蛋白以及认知能力下降，烟酰胺的作用可能是通过增强溶酶体或自噬溶酶体的酸化作用介导[51]。

传统中药姜黄素是从姜黄根茎中提取的一类有神经保护作用的生物活性物质，姜黄素在神经系统具有抗炎、抗氧化、清除自由基的免疫作用，还可以抑制Aβ的形成和聚集，在临床上，对AD的预防和治疗发挥一定作用[52]。AD模型大鼠实验表明，姜黄素可通过提高Belclin- 1、LC-Ⅱ表达水平减轻Aβ堆积、改善小鼠学习记忆能力[53]。川芎嗪是从川芎中提取的生物碱单体，具有扩张血管、清除自由基、改善学习记忆力、保护神经和抗癌等药理作用。研究表明，川芎嗪在AD大鼠脑内亦可发挥显著的神经保护作用，且这种神经保护作用可能与自噬相关[54- 55]。β-细辛醚是草本植物石菖蒲的活性成分，β-细辛醚可作用于与AD相关的多个靶点，能发挥抑制Aβ聚集、保护神经元等作用，其机制可能为降低自噬基因Beclin- 1和自噬相关蛋白LC3β的表达[56- 57]。

综上，mTOR和自噬通路涉及非常复杂的信号网络，且mTOR在自噬调控中发挥重要作用。相关证据显示mTOR信号传导途径的上调在AD的主要病理过程中起重要作用，然而抑制mTOR信号对AD模型的保护作用更有成效。神经元自噬功能障碍是影响AD发展的关键因素之一，自噬的平衡在Aβ和Tau蛋白的代谢、神经炎症中起关键作用。靶向mTOR和自噬的AD治疗药物显示出良好前景。一些药物如雷帕霉素已经在AD患者中进行过测试，并显示出令人满意的结果。然而，在AD动物模型中显示出对AD治疗有效的药物等待更全面的临床试验。