长链非编码RNA在运动改善骨质疏松中的作用机制

杨康 陈祥和 赵仁清 余慧琳 张宪亮 卜文倩

(1扬州大学体育学院，江苏 扬州 225127；2山东大学体育学院)

自20世纪末Xist作为首个调控性长链非编码RNA(LncRNA)被发现以来，大量文献和实验结果显示，LncRNA在人类细胞中存在如H19、MEG3、DANCR等多种亚型〔1〕。LncRNA能调控包括成骨细胞(OB)、破骨细胞(OC)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)在内的多种细胞进而影响骨代谢进程的研究在国内外已有很多，例如LncRNA调节miRNA、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)进而影响OB分化，并在骨质疏松(OP)发生中扮演重要角色〔2〕。有学者通过KEGG PATHWAY对差异表达的去卵巢(OVX)小鼠LncRNA进行分析发现，LncRNA参与调控的Janus激酶信号转导与转录激活子(Jak/STAT)信号通路影响骨细胞的增殖、分化和凋亡〔3〕。此外，LncRNA广泛参与骨形态发生蛋白(BMP)、成骨特异性转录因子(Runx2)、mTOR等多种下游关键因子或与其相关信号通路对骨代谢的调节过程〔4〕。而运动能通过机械外力(肌肉收缩和地面反冲击力)的直接作用影响骨细胞相关信号通路和激素分泌进而调节骨代谢。OP常表现为骨量的流失，是一种以骨质减少和微结构退化为特征的全身性骨疾病，多发于骨组织长期缺少应力刺激和正常机械负荷的因病久卧休息患者、运动功能障碍患者和因性激素缺乏的老年人〔5〕。近来研究发现，长期缺乏运动会导致骨组织代谢功能下降，OP发病风险升高〔6〕。Ma等〔7〕研究发现，OP发生是通过启动C-jun氨基末端激酶/转录因子激活蛋白(JNK/AP)-1信号通路使OC分化和融核增加，增强骨吸收，而运动会抑制JNK/AP-1信号通路，使OC分化和融核减少，进而抑制骨吸收。此外，有研究报导，骨保护素-核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子(OPG-RANKL-RANK)系统相关细胞因子表达改变OP机体骨髓微环境促进OC分化〔8〕。

目前对OP发生机制及其改善预防多集中于运动和OP的表层关系方面，而探讨更深的分子微观层次的研究如LncRNA在运动改善OP中的作用和机制的研究还很鲜见。LncRNA作为调控骨组织代谢的重要因子，通过运动的手段，是否存在某种机制使其对骨组织产生影响，进而改善OP？本文对近年来LncRNA、运动和OP三者相关文献进行综述。

1 LncRNA及其生物学作用

转录生成非编码RNA(ncRNA)序列约占人类基因组的91%，其中包括housekeeping非编码RNA、小分子非编码RNA、中等长度非编码RNA和LncRNA〔9〕。LncRNA是一种长度超过200核苷酸的RNA分子，但不具备编码蛋白质的功能。LncRNA在细胞增殖分化、个体发育、信号转导、干细胞维持、代谢等重要生命活动中发挥关键调控作用，能直接作用于骨形成标记蛋白，调控BMSCs向OB分化〔10〕。其在表观遗传水平、转录水平和转录后水平等方面具有控制基因表达的作用。此外，肿瘤、糖尿病、精神疾病和神经退行性疾病的发生都与LncRNA的异常表达有关〔11〕。研究发现，LncRNA在骨细胞的生长发育与分化过程中意义重大，以顺式和反式作用参与并作用于骨细胞分裂、剂量补偿和细胞分化等过程〔12〕。

LncRNA功能发挥离不开其特有的分子结构，一级结构——核苷酸排列顺序(碱基互补配对)是LncRNA调节靶基因及其上下游基因转录、翻译的基础〔13〕。其能作为竞争性内源RNA(ceRNA)占据靶基因的结合位点，抑制下游miRNA或mRNA与靶基因结合(也有学者将此行为称为靶基因模仿)〔14〕。如与肿瘤发生相关的LncRNA生长阻滞特异转录物(Gas)5被证明能结合糖皮质激素的DNA结合域，竞争糖皮质激素反应元件目的基因并调节其表达〔15〕。这种竞争结合靶基因位点的方式在肌肉分化中也有所体现，基因间长链非编码RNA-MD(Linc-MD)1通过碱基互补配对的方式与miR-133和miR-135结合，竞争性抑制二者与靶基因的结合，进而发挥调节肌肉分化的作用〔16〕。LncRNA二级结构及三级结构(空间结构)是LncRNA 发挥其功能的中枢〔17〕。但目前有关LncRNA二级结构及三级结构在骨细胞分化方面的研究报导较少。Zuo等〔18〕采用RNAfold软件预测LncRNA AK089560二级结构，借助qRT-PCR 检测诱导前后不同时间点AK089560表达的变化，发现LncRNA AK089560呈现为复杂茎环结构，且在成骨分化第2、4、6天表达明显下降，与编码基因Sema3a形成sense overlap关系，与sense overlap同向转录表达。这表明二级结构茎环的AK089560在间质干细胞成骨分化中下调表达，显示二级结构的LncRNA可能参与调控BMSCs多向分化。而目前证明通过调控邻近编码基因表达是许多LncRNA重要的作用方式之一〔19〕。而LncRNA AK089560以同样的方式影响邻近编码基因Sema3a表达，进而调节BMSCs分化。

2 LncRNA在OP中的表达

OP常表现为骨微细结构受损，骨矿物成分和骨基质减少等特征，发病时皮质骨薄化和骨小梁数量下降趋势明显。研究发现，OP常伴随LncRNA的异常表达，而这些异常表达是否是导致OP发病的机制呢？针对此问题，许多学者以不同的方式进行了研究论证。Li等〔20〕研究LncRNA-H19在失用性骨质疏松(DOP)发病中的作用时，发现LncRNA-H19通过竞争性抑制miR-29B-3P而调控Lrp6表达，进而调节Wnt通路功能而参与DOP发病。有研究发现，LncRNA MEG3可参与调控BMSC分化，其在OVX小鼠模型和绝经后OP(POP)患者的BMSC中表达上调，在诱导BMSC向成骨分化的过程中其表达下调，其主要通过下调miR-133a-3p来抑制成骨分化〔21〕。此外，基因间LncRNA uc431+(lincRNA uc431+)及其靶基因ClCF1在POP中表达下调，表明lincRNA uc431+能负向调节靶基因CLCF1〔22〕。Hu等〔23〕在用qRT-PCR分析OP患者血液样本时，发现LncRNA DANCR表达显著上调，而LncRNA DANCR本身具备提高炎性因子白细胞介素(IL)-6和TNF-α的mRNA表达水平及蛋白表达水平的功能。这提示，LncRNA DANCR能以调控炎症因子的方式参与OP发病。有学者在研究OVX小鼠下颌骨OP相关LncRNA异常表达时，发现LncRNA-mmu-16032-P1428960544与LncRNA-mmu-6597-P1428991的过表达，会通过过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ和胰岛素信号通路使OVX小鼠的骨量减少，并加速OC分化〔24〕。陈娟等〔25〕采用genechip技术观察POP肾阴虚证患者外周血液中单个核细胞LncRNA表达水平，在与POP肾阳虚证组和正常对照组对比后，发现前者LncRNA LINC00189表达下调，LncRNA LOC101929378表达上调，并推测LncRNA LINC00189、LncRNA LOC101929378可能通过调控Jak/STAT、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、胰岛素通路和钙离子代谢等信号通路参与POP发病。以上均表明OP发病与LncRNA异常表达有关。笔者通过对近年来相关文献的整理，发现LncRNA在几种OP中存在以下几种表达，表明OP发生可能与LncRNA的异常表达有关。

3 LncRNA在运动改善OP中的作用机制

3.1LncRNA介导运动调控BMSCs 骨形成与骨吸收所共同构成的骨骼内动态平衡是维持人体骨质稳定的重要基础，当由OC主导的骨吸收分化速率大于OB时，OP也就随之发生。而OB自BMSCs分化而来，后者在骨代谢中的作用不言而喻。近年来有关通过间质干细胞移植的方式以增加OB数目，增强OB功能进而改善OP的研究逐渐增多，且已有研究证明此法可行且有效〔26〕。

而LncRNA凭借其二级结构或空间结构为类似于Runx2此类的骨形成标志蛋白和靶标识别提供了更多潜在的可能性〔27〕。LncRNA能直接作用于骨形成标记蛋白，进而来调节成骨分化过程。Zhang等〔28〕在诱导人BMSCs向OB分化时发现，LncRNA XR-11050在OB成骨分化的过程中表达上调，其过表达促进了Runx2表达，进而影响下游骨形成相关蛋白基因表达，最终促进BMSCs向OB分化。此发现证明存在这样一种机制使得LncRNA XR-11050能激活Runx2及其下游相关因子，动员BMSCs的成骨分化。Cao等〔29〕通过过表达LncRNA ak028326或CXCL13降低了高糖环境对小鼠BMSCs成骨分化的抑制影响，并发现后者可正调控前者的基因表达。这表明LncRNA ak028326可通过调控CXCL13表达，以动员BMSCs向OB分化。王雅琦〔30〕利用siRNA转染技术对人肿瘤细胞系进行转染，下调LncRNA BCYRN1表达，发现LncRNA BCYRN1能正向调控Wnt/β-Catenin通路，提高Wnt信号通路及其下游相关蛋白表达。而Wnt蛋白本就具有调节细胞增殖、分化等生物学功能〔31〕。且已有研究显示Wnt蛋白及其下游信号通路在间充质干细胞的增殖及分化过程中发挥重要作用〔32〕。因此推测，LncRNA可能在运动影响下通过正向调节Wnt通路，影响BMSCs的增殖与分化。

此外，Wang等〔33〕在比较BMSCs与向软骨诱导分化14 d后的细胞时发现，其在向ZBED3-AS1和CTA-941F9.9在向软骨诱导分化7 d时显著增高，在14 d时达到顶峰，并持续到28 d软骨诱导分化的细胞中有2 166条LncRNA上调，1 472条LncRNA下调。这一现象表明LncRNA在BMSCs向软骨分化的初期发挥关键调节作用。Xie等〔34〕诱导BMSCs成骨分化10 d，LncRNA芯片及相关分析得出520条LncRNA和665条mRNA差异性表达，包括转化生长因子(TGF)-β的64个信号通路有明显差异，4个具有明显差异表达的LncRNA(ZNF354A-1、LIN54-1、FRG2C-3和USP50-2)使BMSCs成骨分化异常，加速脊髓灰质炎病变。有学者对比SHAM组小鼠和SHAM+EX组小鼠的LncRNA发现，与前者相比，后者有64条LncRNA表达上调，161条LncRNA表达下调〔35〕。这表明运动能对LncRNA表达产生影响。据此推测，运动可能通过影响LncRNA表达，经过Runx2、CXCL13和Wnt信号通路及其下游因子调控BMSCs增殖与分化。

3.2LncRNA介导运动调控OB分化及骨形成 OB是骨形成的主导细胞，其增殖、分化和活性直接关系到骨代谢进程。miRNA是18-23nt的高度保守的非编码单链RNA，在OB分化过程中的作用不容小觑〔36〕。通过整理查阅相关文献，发现LncRNA与miRNA之间存在互相调控的关系，一方面，LncRNA可作为内源性miRNA海绵前体结构，通过与miRNA竞争结合靶基因mRNA的3′-非编码区域(UTR)，间接负向抑制miRNA对靶基因mRNA的调控，即LncRNA可作为竞争性内源RNA(ceRNA)通过miRNA应答元件(MRE)竞争结合具有相同MRE的miRNA调控基因表达〔37〕；另一方面，由于此两者结构的类似，miRNA会通过所谓“种子序列”结合靶基因mRNA的3′-UTR，根据碱基互补配对特异性原则识别靶标，占据LncRNA与靶基因的结合位点，以达到抑制其生物学功能的目的。例如：miR-21能通过Argonaute2蛋白(Ago2)途径调控LncRNA表达〔38〕。而miRNAs可通过与BMPs特异性结合的方式，影响OB。Li等〔39〕在研究BMP-2诱导小鼠ST2细胞向OB分化时，发现miR-2861表达上调，而过表达miR-2861会增加BMP-2诱导分化能力，之后的深入研究发现，其机制是下调组蛋白脱乙酰氨(HDAC5)表达，进而抑制Runx2降解，促进OB分化。另外，还有研究发现，miR-210可负向调控BMP-4来抑制人活化素A受体-IB(AcvR1B)蛋白表达，从而抑制TGF-β/activin信号通路以促进ST2细胞向OB分化〔40〕。以上均表明，miRNA过表达可增加BMPs调节的成骨细胞生化标志物Runx2产生，或抑制TGF-β/activin通路，进而加速ST2成骨分化。无独有偶，Wnt信号通路和Runx2也在诱导成骨分化过程中发挥作用。Liu等〔41〕研究发现，过表达miR-9对C2C12 细胞的Dickkopf相关蛋白(DKK)1蛋白表达水平明显下降，激活Wnt通路，使成骨分化相关基因Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)，骨钙素(OCN)，骨唾液酸蛋白(BSP)表达上调。新近研究显示，细胞在成骨分化过程中Dicer和Runx2表达均上调，荧光素酶实验表明Runx2能促进Dicer表达，而Dicer的上调进一步促进成骨诱导相关miRNA表达上调〔42〕。因此，LncRNA可作为ceRNA负向调控miRNA，下调miRNA的表达进而提高BMPs、Runx2、Wnt通路及其下游相关因子的产生，最终使OB分化增加。而运动可对LncRNA 产生影响。郭健民〔35〕研究证明，中等强度的跑台运动能显著提高OP小鼠的骨密度，提高其骨形成速率和骨强度；同时可以对小鼠骨LncRNA产生一定的影响，造成其表达的升高或降低，例如：LncRNA Gm31126、LncRNA Loc105243692、LncRNA Gm11651等上调明显，LncRNA 105247265等下调显著。因此推测，运动能通过影响LncRNA表达，负向调控miRNA，进而影响BMPs、Runx2、Wnt通路及其下游分子，最终促进成骨分化。

3.3LncRNA介导运动调控OC分化及骨吸收 由OC主导的骨吸收，一旦功能过度增强，骨骼内的动态平衡变化向骨吸收方向偏移，导致骨质疏松发生。mTOR是骨代谢和骨自噬的主要途径。mTOR细胞信号转导主要经由磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)/mTOR和细胞外调节蛋白激酶(ERK)/mTOR路径，通过这两条通路调节骨细胞代谢、增殖、存活与死亡，并与骨细胞自噬紧密相关〔43〕。目前已有研究证明，在肿瘤细胞中，LncRNA能对mTOR进行调控。LncRNA GAS5基因是一种核仁小分子RNA(snoRNA)的宿主基因，位于人类染色体lq25，长度630 nt〔44〕。Jafari Ghods等〔45〕研究发现，沉默LncRNA GAS5的雄激素依赖(Lncap)和雄激素敏感(22Rv1)可使其对mTOR抑制剂的敏感性下降，转染LncRNA GAS5的雄激素非依赖的PC-3和DU145可增加其对mTOR抑制剂的敏感性。此外，基因间长链非编码RNA-P21(lincRNA-p21)lincRNA-p21是瓦伯格效应的调节因子之一。有学者发现mTOR可在乳腺癌细胞中磷酸化热休克因子(HSF)1，提高HSF1依赖的RNA结合蛋白(HUR)的表达，进而控制lincRNA-p21的表达，促进肿瘤的发生〔46〕。以上表明，LncRNA可在肿瘤细胞中对mTOR进行调控，而此机制可能同样存在于骨组织细胞中。而mTOR抑制剂能抑制OC的活性与形成，阻止OVX引起的骨量丢失。因此，LncRNA可能在运动影响下表达上调，增加其对mTOR抑制剂的敏感性以抑制OC生成〔47〕。

此外，与LncRNA通过竞争结合miRNA靶细胞的结合位点，调控成骨分化类似，LncRNA能以相仿的方式影响OC。Krzeszinski等〔48〕在OVX小鼠模型中发现，miR-34a相关处理能显著改善小鼠骨吸收过强引起的骨量丢失，Tgif2可通过RANKL相关转录因子正反馈调节其本身及其相关因子的表达，加速OC的形成与分化。miR-34a能够与Tgif2的mRNA的3′-UTR结合，抑制其促进破骨细胞分化的功能，从而减少骨吸收，达到改善骨质疏松的目的。与RANKL紧密关联的RANK-RANKL通路在骨吸收和骨质疏松发生中发挥重要作用，RANK与其受体RANKL在前体OC表面结合，会加速多核巨细胞向OC分化。miR-106b能和RANKL的3′-UTR，下调其表达，抑制前体破骨细胞聚合，减少OC分化〔49〕。因此笔者推测，存在这样一条机制：运动降低部分LncRNA表达，使其减少与miRNA的竞争，加速miR-34a和miR-106b分别与Tgif2和RANKL的3′端结合，进而抑制OC分化。