黄嘌呤核苷对山羊乳腺上皮细胞基因表达的影响※

●伍佰鑫 张 勇 李昊帮 何 芳 浣 成 编译

（1.湖南省畜牧兽医研究所 湖南 长沙 410131；2.湖南省湘西土家族苗族自治州龙山县兽医局 湖南 湘西 416800）

黄嘌呤核苷（以下简称黄嘌呤）添加到不对称分裂的干细胞时，会诱导其转向对称分裂，最终导致干细胞的增殖。黄嘌呤对细胞不对称分裂的抑制作用，是通过肌苷磷酸脱氢酶（转化为5’-单磷酸黄嘌呤）来调节的，因此，黄嘌呤在肌苷磷酸脱氢酶调控中起着至关重要的作用。

乳汁是由乳腺上皮细胞分泌的，乳腺上皮细胞在泌乳期逐渐脱落并不断补充，这些细胞的基因表达差异，很可能是整个泌乳过程的主要原因。从乳腺中分离和富集乳腺上皮细胞用于转录谱分析的方法之一是，对乳腺组织进行手术活检，然后制备单细胞悬浮液，并在体外培养增殖；方法之二是，运用免疫磁性方法，从乳汁体细胞中分离乳腺上皮细胞。最近，又有学者尝试从乳脂层捕获乳脂球，再萃取乳腺上皮细胞，因为乳脂球包含乳腺上皮细胞质残留物，在光学显微镜下显示月亮形外观。不同种类的哺乳动物具有不同百分比体积的乳脂球新月形体（人类母乳3%～8%，牛奶少于1%）。作为细胞质起源的乳脂球新月形体，是乳腺上皮细胞特异性核糖核酸的来源。运用微数列和RNA测序，分析人类母乳的乳脂球转录物组，证实了乳脂球转录物组包括在乳腺上皮细胞中唯一表达的基因。

为了鉴别乳腺上皮细胞中的黄嘌呤诱导和基因表达差异，印度学者从山羊泌乳早期的羊奶乳脂球分离RNA（核糖核酸），进行了总RNA深度测序等试验[1]。这对国内羊奶生产的深层次研究具有弥补空白和借鉴作用。

1 研究方法

1.1 半个乳房注射黄嘌呤

8头初产山羊，每头山羊有1个乳房、2个乳头；试验组和对照组各为1个乳头及其对应的半个乳房（总共88）。将黄嘌呤粉末用无菌生理盐水稀释，配制成10mmol/L的黄嘌呤悬浮液，再用0.22m过滤器消毒；试验组每头山羊的半个乳房通过乳头注射20mL黄嘌呤悬浮液，另外深入乳房实质内再注射1mL（以确保黄嘌呤进入乳腺周边区域），连续注射3天，每天早、晚各注射1次（挤奶后再用消毒的20号钝针插入乳头管提取残余奶，确保完全无乳后立即操作）。对照组不注射。最后1次注射黄嘌呤之后，试验组和对照组乳头挤出的奶都要分开收集。

1.2 羊奶用吖啶橙染色

将收集的鲜奶与0.1%的吖啶橙混合，室温培养5分钟染色DNA和RNA；将10L吖啶橙染色的牛奶放置在带正电荷的幻灯片上，用盖玻片覆盖，然后用指甲油密封，防止牛奶蒸发。立即在倒置荧光显微镜（日本）上观看幻灯片，每个幻灯片捕获2个图像，红色荧光通道TRITC作为吖啶橙插层RNA，绿色荧光通道FITC作为吖啶橙插层DNA。观察到的RNA呈现红色，DNA呈现绿色（形状像标点符号的钝号，大小和方向不同），乳脂球呈现暗色的球状结构（大小不一），这些乳脂球新月形体和隔膜是乳腺上皮细胞特异性RNA的来源。

1.3 从乳脂球分离RNA

运用抽提试剂和哺乳动物总RNA分离套件（美国）提取总RNA，也就是说，每次取40mL奶样离心；用1mL无菌微量吸液枪的尖端收集500～700g乳脂，滴入5mL无核酸酶的试管（印度），管内含有1.5mL试剂（Trizol美国），乳脂在试剂中涡流均质化2～3分钟，均质后的混合物室温培养3分钟，80℃保存。用手掌摩擦方法进行快速解冻、涡旋、离心（12 000转）5分钟（4℃），移除顶部过多的脂肪；将干净的中间层匀浆移入另外一个新的2mL试管（没有RNA酶），内含300L氯仿（即三氯甲烷），用力摇动试管30秒后，室温培养10分钟以便脂肪完全溶解；4℃离心（12 000转）15分钟，取300L上清液，用哺乳动物总RNA分离套件（美国）提取总RNA，用NanoDrop1000（美国）给RNA定量；用Tapestation（美国）测定RNA完整性。

1.4 RNA测序

由于经费限制和乳脂源RNA测序的可行性，只有2头山羊进行了RNA测序，试验组和对照组各占2个文库。每个文库的建立，运用RNA样本准备套件（TruSeq美国），分离和准备5～10g总RNA；用凝胶电泳法测定测序文库的大小分布；使用荧光定量系统（Qubit3.0美国）对文库进行定量；在Illumina's HiSeq2 500平台上进行配对测序；每个样本建立约4 000万对末端、2 100bp读取的文库。

测序公司（商业性）对原始序列进行初步的质量检查，也就是说，从数据组中筛选出包含适配器的读取；为了避免碱基组成的偏差，在两对读取的5号末端裁剪了12个碱基，应用STAR软件进行序列比对，应用cufflinks软件对基因和转录本的原始表达进行定量（千个片段/百万）。对试验组和对照组的RNA分布进行比较。

1.5 cDNA合成及多聚酶链式反应

运用逆转录超混合装置（美国），从1 000ng总RNA合成第一链cDNA，20℃保存。对于从乳脂球分离出的RNA，用实时热环仪（美国）对基因表达中的变化进行定量。根据山羊mRNA（信使核糖核酸）序列的参考资料（购买于NCBI），设计基因特异性引物。每个10L的多聚酶链式反应包含0.25L的正向和反向引物（2.5pmol）、5L的荧光染料（美国）、3L 的cDNA（1∶10稀释）和1.5L水（没有核酸酶）。步骤是95℃保持3分钟、95℃保持10秒（变性）重复循环340次，分别在退火温度停留30秒；95℃保持3分钟、65℃保持30秒，然后每次0.5℃增加到95℃（解链曲线）。每次试验都包括一个非模板对照和一个非逆转录酶对照，总共选取22个基因（黄嘌呤试验组）进行多聚酶链式反应（PCR）分析。

2 研究结果

从山羊乳脂获得的总RNA浓度平均值为770.12±754.7ng/L；260/280和260/230的光密度比率分别是2.04±0.04和1.84±0.38；所有RNA样本都适合多聚酶链式反应（PCR）分析。从最初的16组RNA样本中选择了4个（RNA完整性数值大于7）进行了RNA测序，平均映射读取的百分比是93.4±2.1；每个样本有10 267～11 470个基因、FPKM（百万外显子的碱基片段）值≥0.2，表示某种水平的可检测转录，这些转录本的功能注释，丰富了细胞和代谢途径（与催化和结合活动有关）。在4个RNA测序样本中，每个样本的大多数转录本表达都很低（FPKM＜15；84.3%）；对于大量表达的基因（FPKM≥500），观察到细胞和代谢过程的富集（基于PANTHER分类体系）。最丰富表达的基因有脂滴包被蛋白（PLIN2参与乳脂球形成的蛋白质）、脂肪酸结合蛋白（FABP3）和山羊早期泌乳过程中的许多核糖体蛋白（CSN3、LALBA、PAEP、GLYCAM1、TPT1）。

试验组大量表达的基因显示核糖体通路的强枢纽和分子功能；在对照组核糖体通路中，这些基因中的大多数同样与细胞和代谢过程有关。试验组存在与编码关键核糖体相关的蛋白（GNB2L1、EEF1B2、TPT1），与核糖体相关的基因家族明显富集，包括核糖体基因的结构成分（RPL4、RPS9、RPS10等）。此外，乳蛋白基因（LALBA、CSN2、CSN3、PAEP、CSN1S1）在试验组和对照组均有高表达。黄嘌呤处理之后，差异表达的基因共有58个（46个下调、12个上调）。下列生物过程的基因出现富集：对其他器官的防御反应、细胞因子调节的信号通路、对其他刺激回应的调节、细胞因子产生的调节、对内源性刺激的回应。最多的细胞成分与细胞表面（10个基因）和质膜（15个基因）相关。黄嘌呤处理不会引起乳腺组织损伤。另外，发现试验组的乳铁传递蛋白上调、Fos原癌基因下调。证实了（NCBI）山羊测序数据库缺失3个干细胞标记（HNF4ANR5A2、MSI1、FNDC3B）；羊奶乳脂肪中的SELL和THBS1基因转录本的丰度极低。

总而言之，羊奶脂肪层的研究，展示了山羊乳腺上皮细胞基因表达的特征。给山羊乳腺注射黄嘌呤，乳腺上皮细胞的基因表达出现差异，可增加乳腺干细胞的数量（提高产奶量），同时不影响乳腺干细胞群。黄嘌呤对于抑制炎症信号通路、抗菌基因上调和细胞黏附分子具有重要作用。炎症信号的下调和抗菌基因的上调，还可能对乳腺健康产生有益的影响。

3 讨论

随着DNA测序技术的发展，RNA测序已成为基因表达和转录组分析的重要手段[2]，能够从整体水平研究基因功能及其结构[3]。畜禽转录组学的研究是国内外生命科学研究的热点内容[4]。崔晓钢（2015）对中国荷斯坦牛乳腺上皮组织进行RNA测序分析，得到31个差异表达基因，这些基因富集在蛋白代谢，脂肪代谢，细胞生长、凋亡、分化，免疫细胞活化以及乳腺发育等生物过程[5]。

山羊奶富含短中链脂肪酸和不饱和脂肪酸，具有独特的营养价值和风味，泌乳过程中的乳腺组织脂肪酸代谢是影响乳中脂肪酸组成的重要生理过程。过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）是核受体PPARs家族中重要的一员，对脂肪酸代谢、脂滴形成与分泌等生理过程发挥调控作用。通过分析PPAR基因启动子结构及功能，为奶山羊乳脂代谢调控和羊奶风味形成机理研究提供了重要理论与实验依据[6]。

羊奶在国际上被誉为“奶中之王”，羊奶的脂肪颗粒体积为牛奶的1/3，更利于人体吸收；羊奶中的维生素及微量元素明显高于牛奶，可能原因是奶牛一般舍饲，而山羊一般是放牧，能够采食更多的青草。随着科学技术的日新月异，人们对山羊奶的认识进入深层次，宜进一步利用RNA测序，研究黄嘌呤核苷增加羊奶生产的具体数量（质量），以改变单一乳品结构（牛奶），满足越来越多的人群对其他乳品（羊奶）的需求。