野生灰树花种质资源筛选与评价

陶祥生 黄卫华

（浙江省庆元县食用菌科研中心，浙江庆元323800）

灰树花（Grifola frondosa），又名栗子蘑、贝叶多孔菌、云蕈、舞茸等，隶属担子菌门（Basidiomycota），蘑菇纲（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），薄孔菌科（Meripilaceae），树花菌属（Grifola）。浙江庆元县有近30年栽培灰树花历史，目前是浙江省唯一的灰树花产区，年栽培量达1600余万袋，为全国最大的灰树花生产地之一。当前庆元县灰树花品种仅“庆灰151”“庆灰152”，品种单一。为此，笔者对收集野生灰树花种质资源进行对比试验，对其遗传特征进行初步的分析和评价，以期为筛选驯化优良灰树花菌株及育种材料提供理论依据和基础材料。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试栽培菌株：3个栽培菌株为庆元县食用菌科研中心的庆灰151、庆灰152和河北燕山科学试验站选育的小黑汀（河北迁西灰树花主栽品种）（表1）。

供试野生菌株：8个野生灰树花菌株均为笔者野外收集分离而得（表1）。

1.2 培养基

PDA固体培养基：1000 mL水加马铃薯200 g（用浸出汁），葡萄糖20 g，琼脂 20 g。培养基pH自然。

表1 供试野生及栽培灰树花菌株

栽培料配方：杂木屑34%，棉籽壳34%，麸皮10%，玉米粉 10%，山表土 10%，石膏粉 1%，红糖1%。料水比 1∶1.1～1.2，pH 自然。

1.3 试验方法

1.3.1 供试灰树花菌株拮抗试验

将各参试菌株两两组合，分别在每个组合平板中心线两侧接入两个不同菌株菌丝块，每个平板3次重复。25℃倒置培养，观察菌丝接触区有无对峙反应。若受检菌株间无带线出现，则表示2个受检菌株的基因极相似或相同，说明种缘关系近；若受检菌株间形成带线，则表示2个受检菌株种缘关系远，是不同菌株。

1.3.2 供试灰树花菌株特异性鉴定

检测方法采用农业行业标准NY∕T 1730－2009《食用菌菌种真实性鉴定ISSR法》。ISSR检测方法严格按照标准NY∕T 1730－2009进行操作，选用了标准附录B中提供的28对ISSR引物中的20对进行检测。每对引物3次重复。电泳结果拍照并统计条带差异。另外，采用SRAP分子标记进行补充鉴定。反应体系为：总体积25 μL，包括10×PCR buffer（Promega）2.5 μL，25 mmol∕L MgCl2（Promega）1.8 μL，模板（50 ng∕μL）1.0 μL，正反向引物（20 μmol∕L）各0.38 μL，Taq 酶（5 U∕μL）（Promega）0.3 μL，10 mmol∕LdNTPs 0.5 μL。反应条件为94℃ 5 min，前5个循环，94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，后35个循环退火温度为50℃，最后72℃ 10 min。反应结束后，取6 μL PCR产物于1.8%的琼脂糖凝胶上电泳，拍照记录。选取特异性较好的20对引物进行扩增，每对引物3次重复。

表2 拮抗试验结果

1.3.3 供试菌株菌丝生长比较

将分离纯化后的供试灰树花菌株转接到培养基平板上，25℃恒温暗培养15 d，用打孔器取直径为5 mm菌饼接种到PDA培养基平板中央，置于25℃恒温暗培养。培养7 d后观察菌落生长情况，并采用“十”字交叉法测量菌落直径，之后每天测量一次菌落直径，连续测量8 d，每种处理设6个重复。计算菌丝平均生长速度，观察记录菌丝长势。

1.3.4 供试灰树花出菇对比试验

栽培袋（15 cm×50 cm×0.005 cm）装湿料1.7～1.9 kg，98～100℃灭菌14～15 h后冷却，接种。每袋接种3穴，接种后再套外袋。

取5袋，25℃暗培养，菌丝萌发后开始测量，每2d划线1次。记录接种到菌丝长满袋的时间、接种到形成子实体的时间。观察比较菌棒发菌差异。

菌丝长满袋（40～45d），第1次刺孔增氧，每棒均匀刺孔25～30个，进入后熟期（10～20d），后熟期结束，就选择菌丝浓密处割口搔菌（割“V”，长1.5～2 cm，深约2～3 mm，刮去菌皮及少许培养料，每个菌棒割口1处），保持空气相对湿度85%～90%、温度22℃左右（恒温），CO₂控制在1000 mg∕kg以下，培养7～10d在割口处即可形成原基。形成原基后移入出菇大棚，增加光照强度（200～500 lx），保持空气相对湿度85%～90%，并加强通风，一般15～20d后子实体发育成熟。采收记录第一潮袋栽和第二潮覆土出菇产量，计算袋单产。每个菌株100棒，3个重复。

2 结果与分析

2.1 拮抗试验

拮抗试验结果供试11个菌株两两组合均发生拮抗反应，说明供试菌株亲缘关系较远（表2）。

2.2 特异性分析结果

将11个菌株送上海农科院食用菌研究所进行特异性鉴定。灰树花待检菌株与对照菌株采用20对ISSR引物及20对SRAP引物进行特异性鉴定。结果显示：灰树花所有待检菌株与对照庆灰151、庆灰152和小黑汀相比均具有特异性，且待检菌株相互之间也具有特异性。限于篇幅，ISSR扩增及SRAP扩增谱图谱略。

2.3 平板培养菌丝生长情况

11个供试灰树花菌株平板培养结果见表3。

表3 供试灰树花菌株平板培养菌丝生长比较

图1 2号灰树花菌株子实体

图2 8号灰树花菌株子实体

图3 14号灰树花菌株子实体

从菌丝颜色、长势以及形态来看，2号、8号、14号、15号等4个菌株菌丝表现出较好的生长势，菌丝生长旺盛，其中14号菌株菌丝生长速度最快，但菌丝颜色不如2号、8号、15号洁白。

2.4 栽培试验结果

灰树花栽培从接种到采收所需时间越短意味着菌袋占场地时间越短，越有利于降低成本，这是筛选灰树花菌株重要指标。从表4可以看出，采自于庆元百山祖高海拔地区的2号、14号形成子实体的时间较晚，具有驯化和选育低温型品种的潜力。

表4 供试灰树花菌株菌丝满袋、原基所需形成时间

供试灰树花菌株产量见表5。

从表5中可以看出8号、14号、19号、15号野生灰树花菌株产量较高，接近主栽品种庆灰151、庆灰152。

3 小结

拮抗试验、分子生物学鉴定表明，所有野生灰树花菌株与对照庆灰151、庆灰152和小黑汀相均具有遗传差异性，且供试野生灰树花菌株之间也具有遗传差异性。

表5 供试灰树花菌株产量比较

2号、8号、14号、15号，4个野生灰树花菌株菌丝表现出较好的生长势，菌丝生长旺盛。

采自于庆元百山祖2号、14号形成子实体的时间较晚，可以作为选育低温型灰树花品种的种质资源。

8号、14号、19号、15号野生灰树花菌株产量较高，接近主栽品种庆灰151、庆灰152有望成为两品种的后备品种。