巨噬细胞及组蛋白乙酰化对其极化的调控①

樊雪梅 容 松

(遵义医科大学附属医院,遵义563003 )

巨噬细胞(Macrophage，Mφ)是极具异质性和可塑性的免疫细胞之一，更是宿主免疫防御系统启动和调节的重要组成部分。Mφ在不同微环境信号刺激下可极化为多种具有不同功能的亚型，其中具有促炎效应的经典活化型巨噬细胞(Classically activated macrophage,M1)和抗炎效应的替代活化型巨噬细胞(Alternatively activated macrophage,M2)是Mφ极化后的两类主要亚型，它们对多种炎症疾病、肿瘤、代谢疾病进展具有重要调节作用。故此，明晰M1/M2极化机制、功能以及如何调控M向两类亚型极化，可能对临床疾病疗法新方向的研究具有重要意义。表观遗传学为学者们提供了从基因层面研究细胞表达变化的理论基础，它是指DNA序列不改变但基因表达发生变化的学科，其调控基因表达变化的机制主要有：组蛋白修饰、DNA甲基化及非编码RNA[1]。这些机制与基因表达的改变有关，并以此实现对不同的细胞发育及功能的调节，包括Mφ极化[2]，这些发现使以操控表观遗传为切入点，从而实现调控Mφ极化极具前景。

1 Mφ的极化、功能及表型特征

Mφ是具有异质性、可塑性及多能性的免疫细胞，主要通过介导促炎和抗炎细胞因子的释放以维持体内平衡[3]。 Mφ可在复杂的微环境中极化为多种亚型，获得不同的功能表型，从而发挥不同的功能。所谓Mφ极化即Mφ响应不同微环境信号，发展为对组织稳态或宿主防御有特定功能表型的过程[4]。 如炎性细胞因子(IFN-γ、TNF-α)、病原体相关分子模式(LPS)和损伤相关分子模式(热休克蛋白、三磷酸腺苷)等微环境可诱导Mφ极化为具有促炎作用的功能表型，这类Mφ被称为M1。另一方面，在Th2细胞因子(IL-4、IL-13)、抗炎分子(IL-10、糖皮质激素、腺苷单磷酸)环境、免疫复合物(IC)和凋亡细胞的诱导下，Mφ可极化为具有抗炎、促受损组织修复的功能表型[5]，这类Mφ被称为M2。M1可通过表达大量的炎性细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)、上调MHCⅡ、共刺激分子(CD40、CD86)、Th1-和Th17-源性细胞因子(IL-12、IL-27)及Th1-源性趋化因子(CXCL9、CXCL10)等，以促进细胞毒性适应性免疫[5,6]。此外，M1还能诱导胰岛素抵抗破坏组织和损害代谢稳态[7]。M2可通过表达IL-10、TGF-β等抗炎分子和表达高水平的内吞受体(CD163、Stabilin-1)、c型凝集素受体(CD206、dectin-1)等参与抗炎过程[5,8,9]。简言之，M1可清除入侵微生物及肿瘤细胞并促进Ⅰ型免疫反应，参与初始炎症，M2主要参与碎片清除、血管生成、组织重塑及伤口愈合并促进Ⅱ型免疫反应，在炎症反应中发挥免疫调节及后期修复作用，此外，M2还与促进代谢稳态免疫、肿瘤生长及进展相关[10-12]。

M1、M2是Mφ极化后的两类主要亚群，亦是该极化过程的两个极端，但仍有多种Mφ极化后的中间表型存在，如目前发现M2的四种附加亚型：М2a 、M2b、M2c、M2d(М2a由IL-4、IL-13等诱导，发挥组织修复作用，M2b由免疫复合物等诱导，发挥免疫调节作用；M2c由IL-10、TGF-β等诱导，发挥抗炎作用；M2d具有肿瘤相关巨噬细胞特征)，以及M3转换表型[13](M3 switch phenotype，已在肺部疾病中发现)。 Mφ极化的类型不同，表达的标记物也不同，如 TLR-4、MARCO受体、CD25、CD80可作为M1的表型特征，甘露糖受体、CD163、CD206等可作为M2的表型特征。Sun等[14]报道CD16、CD32、CD80、CD86、IL-1R、IL-12、IL-23等可作为M1的表面标记，M1可释放IL-12、IL-6、TNF-α、IL-1、ROS、iNOS、NO等炎性细胞因子及CXCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11等趋化因子以招募其他免疫细胞，发挥促炎作用； CCR2、IL-1R(M2a)，CD80、CD86(M2b)，CD150、CD163、IL-1R(M2c)可作为M2各类附加亚型的表面标记，释放IL-10、IL-12、TGF-β、Arg-1、PDGF、MMP-9等因子，发挥抗炎、修复、促纤维化等作用。李康等[15]认为iNOS、IL-12、CD16/32可用于鉴定M1，Arg-1、CD206、Dectin-1可用于鉴定M2。一项mRNA转录表达谱的研究还发现了M1的新标记物：CD38、Gpr18、Fpr2以及M2的新标记物[16]：Myc、Egr2。Mφ发生表型的转换，表达不同的表面标记物及分泌不同的细胞因子，与其所处的环境信号变化及胞内信号变化息息相关。研究表明在不同的微环境中，基因层面转录因子表达的变化调控可指导Mφ发生向M1 、M2表型的转换[2]。信号转导体和转录激活因子3(STAT3)的失活可将Mφ极化为高表达M1标记物的促炎症表型[17]。Mφ极化受STAT1和STAT3/STAT6细胞信号之间平衡的调控。此外，STATs、IFN-调节因子(IRF)[18]、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ、核因子(NF)-κB和激活蛋白(AP)等细胞信号传导成分在Mφ极化中过程也起极其重要的作用[2]。若能操控这些信号基因表达的变化，继而调控Mφ向抗炎性M1及促炎性M2的转换，实现对不同疾病阶段的控制，可能是当前学者们值得努力的方向。

前文提到表观遗传修饰可改变细胞基因表达，而组蛋白乙酰化又是表观遗传学机制中最常见的类型，故学者们对如何操控组蛋白乙酰化的变化从而达到调控Mφ的极化燃起了极大兴趣，下文将总结近年来组蛋白乙酰化调控Mφ极化的研究进展。

2 组蛋白乙酰化对巨噬细胞极化的调控

表观遗传控制基因表达对细胞分化和发育至关重要，Mφ的极化也受组蛋白修饰等机制调控。组蛋白修饰包括：乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化、磷酸化、ADP核糖基化、脱氨作用、泛素化和SUMO化等，这些机制可通过改变影响染色质结构的组蛋白的电荷，对细胞基因表达进行上调或下调[2,19]。TLR可诱导Mφ中组蛋白的乙酰化，该变化可致染色质重塑和促进炎性基因表达[20]。组蛋白乙酰化及去乙酰化是组蛋白修饰的常见类型，由乙酰转移酶(HATs)和脱乙酰酶(HDACs)催化。 HAT从乙酰CoA转移乙酰基到赖氨酸侧链的ε-氨基，实现组蛋白的乙酰化，这对染色质重塑和基因表达具有重要作用，而HDAC则是从赖氨酸尾部去除乙酰基使其去乙酰化。组蛋白乙酰化后，其正电荷被中和，使组蛋白和DNA链之间的相互作用减弱，导致组蛋白N-末端从DNA链移开[21]，提供对DNA调节元件更大的可及性，这些变化使染色质结构改变，最终上调基因表达。而组蛋白的去乙酰化则提供了对DNA调节元件的转录抑制。抑制HDAC可降低组蛋白的去乙酰化，提供更大的染色质结构可及性及增加基因表达，抑制HATs则可减少基因表达[22]。

2.1组蛋白乙酰化促进Mφ极化 HAT是一组具有不同催化结构域的蛋白质，分为：Gcn5 N-乙酰转移酶(GNATs)和Morf、Ybf2、Sas2、Tip60 HATs两个家族，除此以外还有一类非典型的HAT：如p300/CBP、核受体共激活因子，它们是同样具有催化乙酰转移酶活性功能的蛋白质，但不具典型的HAT结构域[23]。HAT可调控M1、M2的基因表达。Feng等[24]的研究显示 p300/CBP在一系列条件下可将干扰素调节因子5(IRF5)乙酰化，促进靶基因(如与M1极化相关的因子TNF、IL-6、IFN-γ等)的H3组蛋白乙酰化，从而上调这些靶基因的表达，以促进M1极化。 来自寄生虫的某些分泌性因子可下调TNF、IL-6、NOS2等靶基因在M1小胶质细胞(中枢神经系统原位Mφ)中的表达。这些分泌性因子抑制靶基因中的H3K4me3和H3K9/14Ac(H3组蛋白的两种修饰：三甲基化赖氨酸4和乙酰化赖氨酸9/14)，并促进RNA聚合酶Ⅱ募集到Arg1启动子(Arg1是M2的表面标记物)[25]。

2.2组蛋白去乙酰化促进Mφ极化 HDAC催化组蛋白去乙酰化是一个动态的过程，目前发现并鉴定的有18种哺乳动物的HDAC，其分以下五类：Ⅰ类(HDAC1，HDAC2，HDAC3)、Ⅱa类(HDAC4，HDAC5，HDAC7和HDAC9)、Ⅱb类(HDAC6和HDAC10)、Ⅲ类(由NAD+依赖的HDACs组成)和Ⅳ类(HDAC11)[19,23]。Chen等[26]对HDAC3的研究表明，该酶可使IFN-β表达增加以促进Mφ对LPS的反应性。在动脉粥样硬化疾病研究中亦发现该酶还可增强IL-6、NO的分泌及抑制TGF-β表达[27,28]。HDAC3在Mφ中具有促炎效应，该促炎作用可结合PU.1并抑制M2信号基因H3K9的乙酰化[29]，而PU.1是转录因子ETS家族的重要成员,在机体免疫调节及炎症反应中起核心调节作用[30]。总之，HDAC3是M1极化的关键启动子，促进M1极化的同时，还可抑制M2极化[31]。Ⅱa类HDACs(如HDAC7)也被证明可以促进M1表型，可与低氧诱导因子1-α相互作用并诱导M1中IL-12b、IL-6等炎性因子的表达[32]。

抑制Mφ中几种Ⅰ类和Ⅱ类HDAC将下调模式识别受体、活化标记物，细胞因子及趋化因子的表达水平，同时，也影响活性氧(ROS)、NO的分泌及诸如趋化、吞噬作用、细胞凋亡等过程[27,33]。如Lugrin等[34]报道：具有促炎作用的巨噬细胞移动抑制因子(MIF，可促进Mφ极化为M1)是HDAC抑制的下游靶点，Wang等[35]认为抑制HDAC可通过诱导原位小胶质细胞极化为M2型，从而发挥脑损伤后的保护作用。Thangavel等[36]、Nilubol等[37]、Morales等[38]认为抑制HDAC可调节与炎症、癌症、心血管病等多种疾病相关的不同基因的乙酰化状态。HDAC抑制剂(如曲古霉素A、Scriptaid、ITF2357、丙戊酸)治疗动物呼吸道炎性损伤及消化道疾病的研究也表明，HDAC抑制剂可减少炎性细胞因子、趋化因子及M1的表达，促进M2极化，从而发挥调控炎症的作用。Aung等[39]将曲古霉素A(通过螯合HDAC中心的锌指结构进而抑制酶活性的酶抑制剂)引入细胞后，发现Ccl2、Ccl7、Edn1(由M1表达)受到抑制，从而减轻炎症，它还能通过磷酸化p38MAPK减轻TNF-α、NO、ROS等促炎因子的表达。类似地，Wang等[35]利用Scriptaid经增加糖原合酶激酶3β(GSK3β)表达，使小胶质细胞极化为M2型。Glauben等[40]证实ITF2357可减少IL-6及其受体(可由M1高表达的炎症性因子)的表达，丙戊酸可通过下调促炎细胞因子的表达及细胞标志物CD40和CD80以减弱M1的表达[41]，同时下调抗炎细胞因子CD86 以增加M2的表达。此外，抑制Mφ中的HDAC3后，LPS诱导的IFNb启动子的组蛋白乙酰化几乎完全消失(IFNb基因的诱导和下游IFN的响应强烈依赖于HDAC3)，抑制HDAC6的研究也证实了该抑制作用可下调促炎反应和上调IL-10(一种多能抗炎因子)的表达以保护LPS所致的损伤[42]。Hu等[19]在百草枯诱导的肺纤维化模型中发现，抑制HDAC可增加IL-6表达(M1高表达，在肺纤维化中起核心作用)及增强CRISPR-ON转录激活系统(一种RNA引导的转录激活系统，可有效诱导特异性基因表达)以促进IL-6转录的能力[43,44]。

由此可见，HDAC酶家族具有促进M1极化、增强Mφ中LPS的反应性的功能，HDAC抑制剂可通过调节疾病中各种细胞因子的转录状态，从而发挥其靶向治疗的作用，这可能对临床抑制Mφ介导的炎症治疗具有一定潜力和引导价值。大量研究证实[45]：HDAC抑制剂具有抑制各种炎症和IFN靶基因诱导的效应，可减少M1及M1促炎性细胞因子的表达，促进Mφ向抗炎性M2极化的功能。组蛋白去乙酰化或乙酰化是调节Mφ极化走向重要机制之一(另一重要机制是DNA甲基化与去甲基化)。研究表明联合使用甲基化抑制剂(Aza)和HDAC抑制剂(TSA)可减少M1表达，同时增加LPS诱导的小鼠骨髓衍生Mφ中M2的表达[36]，联合使用Aza + TSA可显著降低LPS诱导的小鼠骨髓衍生Mφ中趋化因子和炎性细胞因子mRNA的表达，单独使用TSA处理LPS诱导的Mφ，其 NO合酶表达降低，而CD206(M2表面标记物)表达增加[36]。

3 展望和挑战

Mφ可在不同微环境刺激下极化为功能不同的亚型，当机体受损时，Mφ首先极化为促炎性M1，释放促炎细胞因子、趋化因子等，参与损伤的初时炎症反应，该类炎症因子的表达较短暂，并很快被抑制到接近基线的水平[45]，随后具有抗炎性的M2表达增加，抑制M1表达的同时还分泌IL-10等抗炎性因子，促进损伤组织的修复重塑及稳态的保持，但若该状态持续，损伤组织可能因过度保护而形成不可逆转的纤维化病变。表观遗传修饰具有确定组织损伤部位Mφ命运的能力[2]，利用表观遗传修饰调控Mφ极化走向的研究可能对未来治疗Mφ介导的疾病具有重要指导意义，针对靶基因进行对应表观遗传修饰，从而使相应疾病阶段的有害Mφ亚型表达减少，有益Mφ亚型增加，此类治疗方案可能是未来临床基因疗法的方向。然而，表观遗传修饰调控Mφ极化及功能的研究仍处早期阶段，未来研究令人期许的同时，我们也面临着巨大的挑战，如进行靶基因修饰后目标Mφ亚型表达的减少或增加恶性持续，可能会对机体造成更大的损伤，如何把握及停止其增殖或减少程度，是我们将不断深入研究的课题。再者，基因靶向修饰的研究尚处早期阶段，临床试验更是少见，在该类技术运用到人类之前，仍需要大量临床研究的支持。