氧化还原酶DHTKD1基因突变致病机制及小鼠模型研究进展

沈 艳, 徐汪洋, 朱后保

(上海交通大学医学院附属瑞金医院实验医学研究中心, 上海 200025)

2-酮戊二酸脱氢酶以及2-酮己二酸脱氢酶广泛存在于真核细胞的线粒体中，通过催化氧化还原反应最终产生乙酰辅酶A(acetyl-CoA)进入三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA), 产生三磷酸腺苷(ATP)为机体提供能量。其中, 脱氢酶E1和转酮酶结构域1(dehydrogenase E1 and transketolase domaincontaining 1，DHTKD1)参与赖氨酸以及色氨酸代谢，催化氨基酸代谢的中间产物2-酮己二酸生成戊二酰辅酶A(glutaryl-CoA)[1]。近年来,DHTKD1基因突变被陆续报道与多种遗传性疾病的发生有关,包括腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)[2]、氨己二酸酮己二酸尿症(2-aminoadipic and 2-oxoadipic aciduria，AMOXAD)[1,3,4]和嗜酸细胞性食管炎(eosinophilic esophagitis，EoE)[5](表 1)。报道中均指出此类疾病的发生可能与DHTKD1基因突变所导致的线粒体功能缺陷有关。

DHTKD1基因位于常染色体10p14[6], 2000年由日本长濑研究组克隆[7]。DHTKD1基因包含17个外显子，编码框长5 202个碱基，编码919个氨基酸[2]。DHTKD1蛋白与酮戊二酸脱氢酶非常相似，起初被认为是酮戊二酸脱氢酶复合体的E1组分参与三羧酸循环[6,8,9]。后来被证实，DHTKD1蛋白催化酮己二酸脱氢反应，最终产物乙酰辅酶A进入三羧酸循环[9]。

DHTKD1蛋白参与线粒体能量代谢，它在能量需求旺盛的组织器官中高表达。小鼠体内，DHTKD1在肝脏表达最高，背根神经节以及脊髓次之, 在肾脏、乳腺以及睾丸中的表达也相对较高[10]。在人体组织中，正常组织肝脏肾脏表达最高，肿瘤组织中肝癌组织表达最高。这充分说明DHTKD1在能量代谢中发挥着重要的作用，DHTKD1基因突变导致的其功能的缺陷对线粒体、细胞以及机体造成重大影响。

1 DHTKD1基因突变与人类疾病的关系

1.1 DHTKD1基因突变与CMT

CMT是一种较常见的遗传性周围神经系统疾病, 该病在人群中的发病率约为万分之四[11]。该病主要呈常染色体显性遗传(autosomal dominant, AD)，也可呈常染色体隐性遗传(autosomal recessive, AR)及X连锁显性遗传(X-linked dominant, XD)或X连锁隐性遗传(X-linked recessive, XR)[11]。CMT患者在患病初期往往表现出弓形足及杵状指，由于下肢无力而呈现跨越步态。随着疾病的进展，部分患者出现手部肌肉无力和萎缩，造成精细动作困难。末端神经功能的丧失还会导致感觉功能减退。该病大多在青少年期起病，也可延迟至中年起病[11]。迄今为止，已报道[12]有50多个基因与CMT的发生相关，其中外周髓鞘蛋白22(PMP-22)、髓鞘蛋白零(MPZ)、间隙连接蛋白32(Cx32)异常是导致CMT的常见致病基因。

表 1 DHTKD1基因突变位点及相关疾病

2012年，Xu等[2]研究人员在一个常染色体显性遗传的中国人CMT家系中鉴定出DHTKD1基因第8外显子cDNA序列1 455个核苷酸由T 变为G，导致该三联密码子编码的氨基酸由丝氨酸变为终止密码子。患者表现为不同程度的以下肢为重、并累及上肢的肢体远端肌肉萎缩和无力，但无明显感觉障碍。体外实验证明无义突变造成mRNA稳定性的下降，由此产生的单倍型不足效应造成正常蛋白质量的减少，从而引起临床表型。同时，Dhtkd1基因敲除小鼠具有严重的代谢紊乱、线粒体功能障碍以及典型的CMT表型[10]。

1.2 DHTKD1基因突变与AMOXAD

赖氨酸代谢是一个复杂的过程, 涉及线粒体、细胞质和过氧化物酶体等。AMOXAD是一种常染色体隐性遗传的先天性代谢性疾病，多由赖氨酸、羟赖氨酸和色氨酸代谢通路上的酶缺陷导致疾病的发生，临床上以在病人尿中检测出过量的2-氨基己二酸(2-AAA)和2-酮己二酸(2-KAA)为特征。AMOXAD的临床表现纷繁多样，迄今发现的20多个患者中，一半以上是没有明显可见的临床表型，其他人则表现为不同程度的脑发育迟缓、早期发育缓慢、代谢性酸中毒、共济失调、惊厥、癫痫、肌张力减退、运动功能障碍等[13,14]。

迄今为止，已发现在DHTKD1上的多个突变与AMOXAD的发生有关。最常见的是c.2185G＞A(p.G729R)和 c.1364G＞A (p.R455Q)。突变的DHTKD1单倍型不足，表达降低甚至功能缺失，使得赖氨酸代谢中间产物2-AAA和2-KAA在体内积累,最终导致酸尿症[1,3,4]。小鼠实验表明，Dhtkd1基因缺失导致小鼠尿液中2-AAA和2-KAA显著升高[10],说明Dhtkd1缺失的确阻断了2-KAA向戊二酰辅酶A的反应过程。

1.3 DHTKD1基因突变与EoE

EoE是一种慢性变态反应性疾病。婴幼儿患者表现为呕吐, 营养不良性发育缓慢。成年患者表现为吞咽困难及食物嵌塞[15,16]。越来越多的研究[17,18]表明EoE是遗传因素和环境因素共同作用的结果。大多数遗传学研究[19,20]都集中在染色体2p23和5q22上的常见遗传变异及连锁分析上。基因表达谱和免疫学分析表明[21,22]，该疾病是强烈的2型免疫相关炎症反应过程。最近，研究人员利用全外显子测序鉴定出DHTKD1基因的多个突变与EoE有关。进一步研究表明，DHTKD1缺失导致食管上皮细胞线粒体功能障碍，活性氧升高以及Viperin表达升高[5]。Viperin与T细胞中Th2细胞因子的产生有关[23]。

2 Dhtkd1基因敲除小鼠模型

基因敲除小鼠模型是在体研究基因功能的理想工具。由于对DHTKD1的研究目前还处于起步阶段,仅有Xu等以及德国的Biagosch等构建了Dhtkd1的基因敲除小鼠[10,24]。但是2种基因敲除小鼠有明显的不同, 包括敲除策略以及最后产生的表型均不相同。

2.1 Dhtkd1基因敲除方法及策略

为了使小鼠模型尽可能的模拟人类AMOXAD患者所携带的c.1228C＞T (p.Arg410*)突变, Biagosch等[24]用TALEN(transcription activator like effector nucleases)技术敲除小鼠Dhtkd1第7外显子上的片段。结果该小鼠仍然表达Dhtkd1蛋白N端431个氨基酸多肽。也许正是这个长431个氨基酸的肽段在小鼠体内发挥作用。Xu等[10]用传统的胚胎干细胞基因打靶技术敲除Dhtkd1第2到4外显子, 并产生移码, 最终小鼠体内只可能产生55个氨基酸的多肽。这是两种小鼠表型差异的根本原因。

2.2 Dhtkd1基因敲除小鼠模型表型

Biagosch等[24]得到的Dhtkd1的基因敲除小鼠(Dhtkd1p431*)3月龄时，无论是握力分析、倒置格栅还是平衡木分析，与野生型小鼠表现无异。这与DHTKD1突变的氨己二酸酮己二酸尿症患者轻微甚至无症状的表现一致。生化检测Dhtkd1431*小鼠2-AAA和2-KAA在肝脏中明显升高。这与DHTKD1突变的AMOXAD患者也是相符合的。Xu等[10]构建的小鼠(Dhtkd1p55*)具有典型的CMT表型，包括肢体远端运动性肌无力和萎缩、感觉功能障碍，并伴有神经传导速度下降。此外，DHTKD1缺陷导致严重的代谢异常，尿中2-AAA和2-KAA显著增加。

2.3 Dhtkd1基因敲除小鼠模型优缺点及应用

Dhtkd1p431*和Dhtkd1p55*小鼠体内2-AAA和2-KAA均有不同程度的升高, 进一步验证了DHTKD1是氨基酸代谢通路上的氧化还原酶。Dhtkd1p431*小鼠模拟了AMOXAD患者体内点突变, 可以用来研究DHTKD1蛋白N端及C端结构域的生物学活性[24]。Dhtkd1p55*小鼠可以用来研究DHTKD1整个蛋白的功能，包括其在神经系统能量代谢中的作用[10]。Dhtkd1p431*小鼠与野生型小鼠的比较研究可以用来阐明DHTKD1蛋白C端结构域的功能，而Dhtkd1p431*小鼠与Dhtkd1p55*小鼠的比较研究可以用来阐明DHTKD1蛋白N端结构域的功能。而针对DHTKD1蛋白不同结构域的研究，可以表明DHTKD1蛋白不同结构域的不同功能，比如催化位点、结合位点等，进而可以针对不同的位点开发设计抑制或拮抗性药物[10,24]。

另外，一种现有的DHTKD1基因相关的小鼠模型是郭文婷[25]报道的Dhtkd1Y486*基因敲入小鼠模型，该模型完全模拟了人类CMT 2Q中DHTKD1 c.1455T＞G (p.Tyr485*)突变，由于该小鼠模型突变位点与D h t k d 1 p 4 3 1*小鼠突变位点较近，Dhtkd1Y486*小鼠只是在超微结构上表现出了类似CMT的表型，并没有表现出类似CMT2Q患者的严重症状[25,26]。

总之, Dhtkd1p55*小鼠适用于在体研究DHTKD1的功能，而要进一步研究DHTKD1关键位点的作用或者DHTKD1有关点突变导致AMOXAD的机理,需要使用相关点突变的基因敲入小鼠，比如Dhtkd1p431*和Dhtkd1Y486*等。但是, 尚不清楚点突变的基因敲入小鼠是否会与Dhtkd1p431*和Dhtkd1Y486*小鼠一样无明显症状。

3 小结和展望

研究表明[8]，DHTKD1与线粒体功能密切相关。DHTKD1沉默的细胞中ATP减少，活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)升高，最终导致细胞的凋亡。以上这三种疾病的发生也与线粒体息息相关。线粒体存在于所有的组织细胞中，那么DHTKD1导致的线粒体障碍是否影响其他的组织细胞呢？DHTKD1在肝脏中表达最高，肝脏的生理功能以及肝癌的发生可能与DHTKD1有关, 包括肝脏损伤后的修复以及肝脏再生的潜能。DHTKD1在脊髓中的表达相对较高，这是否与脊髓的损伤修复有关？是否与神经元的再生有关？另外，DHTKD1还在乳腺组织高表达，癌细胞的快速增殖是能量高度依赖性的，那么肝癌以及乳腺癌甚至其他癌症类型可能与DHTKD1介导的能量代谢密切相关。这些问题都有待在以后的研究中进一步探索。Dhtkd1基因敲除小鼠完全模拟了CMT及AMOXAD[10]，为深入研究这两种疾病的发病机制提供了条件，为探索DHTKD1在其他组织器官中的作用提供了可靠的工具。

综上所述，这些研究为我们揭示了DHTKD1中罕见突变导致的线粒体功能缺陷潜在危险因素，也为我们提供了遗传疾病中存在的罕见的遗传变异的多样性，并强调了相关表型的遗传复杂性。