大鼠脑实质注射血清所致病理改变及其相关机制的研究

赵志靖, 第五飞虎, 邓毅恒, 杨利孙

(长安医院神经外科, 西安710016)

脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是严重威胁人类健康与生活质量的高致死率和高致病率的临床常见病[1]。ICH后血肿形成过程中会释放大量血清，血清中含有大量生长因子、炎症因子等可能会与ICH后周围组织水肿有关[1]。水通道蛋白(AQPs)家族是一组构成水通道与水通透有关的细胞膜转运蛋白, 脑组织中AQPs主要为AQP-4, AQP-4在脑内主要分布于星形胶质细胞、脑表面的软脑膜、脑室系统的室管膜等, 在维持大脑水平衡发挥重要作用[2]。本实验旨在探讨大鼠脑实质注射血清所致病理改变以及血清对AQP-4的影响, 以期进一步解释脑出血后继发性脑水肿的病理生理机制。

1 材料与方法

1.1 材料

成年雄性清洁级SD大鼠60只，体质量(250±30) g，购自空军军医大学实验动物中心[SCXK(军)2012-0007]。大鼠星形胶质细胞株(R1800)购自上海中乔新舟生物科技有限公司。兔抗大鼠AQP-4抗体购自美国Abcam公司，山羊抗兔二抗、胎牛血清(FBS)、DMEM培养基、丙酮酸盐溶液均购自美国Thermo Fisher公司。总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自美国Promega公司。腐胺、亚硒酸盐、多聚赖氨酸均购自美国Sigma公司。

1.2 动物分组与动物模型的建立[3]

60只大鼠随机分成实验组与对照组，每组各30只。造模前一周进行平衡木训练。实验组处理方法:使用异氟烷气体麻醉大鼠，固定于立体定位仪，暴露实验鼠前囟，在前囟右侧旁开3 mm处钻开颅骨，微量注射器注射20 μL常温10%FBS，深度为5 mm, 注射速度为1 μL/min。注射后停留10 min退针。对照组处理方法: 仅微量注射器注射20 μL生理盐水，其余处理同实验组。两组均在术后48 h进行行为学评分，评分后处死大鼠取材，两组各随机选取20只大鼠脑实质组织提取总蛋白或总RNA后置于-70 ℃冰箱保存，其余均用于脑含水量测定。

1.3 行为学观察

参考文献所述方法[4]，利用平衡木评分法对术后48 h两组大鼠进行评估，观察其行为学变化。让大鼠通过升高的平衡木，进入较暗的饲养箱。评分标准如下: 0分，能跳上平衡木，在上面行走不会跌倒; 1分，能跳上平衡木，在上面行走跌倒机会少于50%; 2分，能跳上平衡木，在上面行走跌倒机会大于或等于50%; 3分，在健侧后肢的帮助下能跳上平衡木，但受累瘫痪侧后肢不能帮助向前移动; 4分，在平衡木上不能行走，但可以坐在上面; 5分，将大鼠放在平衡木上会掉下来。3次测试结果的平均分作为最后成绩。

1.4 脑实质含水量测定

采用干湿质量法对大鼠脑实质含水量进行测定，术后48 h处死大鼠取脑组织，将脑组织称湿重后立即放入恒温电烤箱内8 h, 设置温度为120 ℃，称取干质量。脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.5 脑实质组织学观察

制备常规标本，进行HE染色，光学显微镜下观察; 制备电子显微镜标本，经半薄切片定位制成超薄切片，在透射电子显微镜下观察。

1.6 细胞无血清培养及实验分组

大鼠星形胶质细胞株用含体积分数10% FBS的DMEM培养基(完全培养液)置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中孵育，当90%细胞贴壁时，用胰酶消化传代。实验前24 h，调整细胞浓度，按照1.5×105/cm2接种到已经包被多聚赖氨酸的培养板上，15 min后将上清去掉，添加新鲜无血清培养基或者血清培养基，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。无血清培养基(SFM)配方参考文献[5]进行配置。按照SFM和有血清培养基[无血清培养基加入10%FBS(SFM+10%FBS)]，随机分为SFM组与SFM+10%FBS组，细胞分别在SFM和SFM+10%FBS培养基中培养7 d，提取总蛋白或总RNA后置于-70 ℃冰箱保存。

1.7 蛋白免疫印迹

从组织或细胞提取的蛋白用100 g/L SDS-PAGE电泳分离, 转膜、室温封闭后, 分别加兔抗AQP-4(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入羊抗兔二抗(1∶2 500)孵育2 h，洗膜后，用增强化学发光法显色、显影，凝胶成像分析系统摄像分析，并以β-actin为内参。

1.8 逆转录PCR

用组织或细胞提取的总RNA，逆转录得到相应的cDNA，以该cDNA为模板，采用逆转录PCR法检测AQP-4的转录水平，并以β-actin为内参。引物由空军军医大学西京医院肝胆外科实验室设计，AQP-4引物上游序列: 5'-TTGGACCATCATAGGCGC-3', 下游序列: 5'-GCATGTGATCGACATTGACC-3', 扩增片段长214 bp; β-actin引物上游序列: 5'-ACTCCAACACCCCAGCCATG-3', 下游序列:5'-CTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGG-3'，扩增片段长698 bp, 相关引物均由上海生工公司合成。

1.9 统计学分析

采用SPSS 18.0软件包进行统计分析，每组实验均重复3次, 计量资料用x-±s表示, 两组资料之间比较采用t检验，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠生存率、行为学评分及脑实质含水量的差异

实验组大鼠死亡6只, 生存率为80.00%, 对照组大鼠死亡1只, 生存率为96.67%, 差异有统计学意义(P＜0.05)。平衡木行为学评分, 实验组和对照组分别为(4.50± 0.35)分和(2.73± 0.37)分(P＜0.05)。大鼠注射部位脑组织含水量，实验组和对照组分别为80.12%±0.51%和77.22%±0.35%(P＜0.05); 实验组和对照组大鼠注射部位对侧脑组织含水量分别为76.10%±0.03%和76.45%±0.04%(P＞0.05)。

2.2 两组大鼠脑组织超微结构的差异

两组大鼠脑组织经常规HE染色, 光学显微镜下对照组大鼠注射部位周围组织大致正常, 未见明显异常(图1A1), 实验组大鼠注射部位周围组织呈轻度到中度水肿(图1B1)。透射电子显微镜观察显示, 相对于对照组(图1A2), 可见星形胶质细胞胞体容积增大,细胞质疏松, 细胞器减少, 细胞核增大, 甚至部分细胞核核体胀破, 少数细胞表现为气球样变(图1B2)。

图 1 两组大鼠脑组织HE染色(×100)和超微结构的差异(×10 000)

图 2 两组大鼠脑实质AQP-4蛋白及mRNA表达的差异

2.3 两组大鼠脑实质AQP-4表达的差异

实验组大鼠注射部位脑组织AQP-4蛋白及mRNA表达量显著低于对照组，同样显著低于对侧脑组织(P＜0.01); 实验组注射部位对侧脑组织AQP-4蛋白及mRNA表达量与对照组未见明显差异(P＞0.05)(图 2)。

2.4 血清对星形胶质细胞表达AQP-4的影响

相对于SFM组, SFM+10%FBS组表达AQP-4蛋白及mRNA均明显下降(P＜0.05)(图3), 显示血清可直接从转录水平抑制大鼠星形胶质细胞AQP-4的表达。

3 讨论

图 3 血清抑制星形胶质细胞AQP-4蛋白及mRNA的表达

ICH后首先由于血脑屏障破坏导致血管源性脑水肿, 然后继发性的细胞毒性脑水肿进一步加重病灶周边脑实质细胞损伤, 导致严重的脑水肿发生[6-7]。ICH后病灶周围组织水肿的发生可能与病灶炎症因子释放、激活相应的信号通道密切相关，然而，血脑屏障破坏后，血管外的血清是否直接导致病灶周边脑实质细胞的水肿，目前并不清楚。本研究利用大鼠脑实质注射模型证实血清可导致注射部位侧含水量明显增加; 组织经光学显微镜与透射电子显微镜观察均见组织与细胞水肿; 实验组大鼠48 h生存率下降、大鼠肢体活动、平衡力明显下降，显示血清可直接导致脑实质水肿的发生。该大鼠脑实质注射血清模型，模拟ICH后渗出的血清对脑组织的病理过程，结果显示ICH后血清渗出刺激，是ICH后病灶周围细胞水肿的重要机制，该机制是否能进一步解释长期服用阿司匹林引起的ICH患者预后相对较差的情况，尚需要进一步深入研究。

研究表明, ICH后星形胶质细胞可出现形态学、迁移能力上的改变, 表现为细胞核增大、胞体肥大、气球样变等水肿病理损伤改变[8-10]。在研究如何纯化与培养啮齿类动物星形胶质细胞实验中，同样显示血清所导致的星形胶质细胞相同的形态学改变[11]。在本研究中同样观察到，培养基中加入10%FBS后，在倒差显微镜下观察大鼠星形胶质细胞形态，可见细胞胞体容积增大，细胞质疏松，细胞核增大，甚至部分细胞核核体胀破，少数细胞表现为气球样变，结合动物实验结果显示，血清可直接导致星形胶质细胞发生细胞毒性水肿。

AQPS主要功能是转运水，脑组织中AQPS主要为AQP-4，AQP-4在脑内主要分布于星形胶质细胞、脑表面的软脑膜、脑室系统的室管膜等, 是星形胶质细胞与脑脊液以及血管之间的水调节和运输的重要通道蛋白, 参与脑脊液重吸收、脑细胞渗透压等调节, 在维持大脑水平衡发挥重要作用[11-14]。越来越多的研究表明[15-18]，AQP-4在血管源性脑水肿形成中起重要的作用，AQP-4基因敲除后，可诱发实验动物发生血管源性脑水肿。本研究显示血清可导致注射部位侧脑实质脑水肿的发生，同时脑实质AQP-4蛋白及mRNA表达均明显下降，提示AQP-4可能是血清引起到脑组织水肿的重要分子机制。进一步实验表明，在培养基中添加10%FBS可引起大鼠星形胶质细胞AQP-4蛋白及mRNA表达的下降，同时引起细胞胞体容积增大，细胞质疏松, 细胞核增大，甚至部分细胞核核体胀破，少数细胞表现为气球样变，显示AQP-4表达下降，导致星形胶质细胞调节脑组织内渗透压、水平衡的能力下降，无法将脑实质内多余水分排出, 从而导致脑水肿发生。尽管本实验在体内与体外均证实血清直接刺激脑水肿与细胞水肿的发生，然而血清中成分复杂，含有大量生长因子、活化因子，具体哪一种成分是导致脑实质及星形胶质细胞表达AQP-4下降尚需要进一步研究阐明。

综上所述，本研究利用大鼠脑实质注射血清模型，模拟ICH后血清对周围脑组织的影响，结果证实血清可直接导致脑水肿的发生，同时伴随AQP-4表达下降。进一步的体外实验证实，血清同样可导致大鼠星形胶质细胞水肿的发生，同时伴随AQP-4蛋白及mRNA表达下降，体外与体内实验共同表明，血清导致脑组织、尤其是星形胶质细胞AQP-4表达下降可能是ICH后继发性脑水肿的重要分子机制，为未来治疗ICH后脑水肿治疗提供新的治疗靶点。