双歧杆菌对慢性酒精性肝损伤大鼠肝功能保护作用的探讨

林惠武，林燕琼，林志辉

(1. 厦门大学附属第一医院 药剂科，福建厦门 361003； 2. 福建省立医院消化内科， 福州 350001)

酒精依赖和滥用已成为目前我国甚至全球范围内备受关注的健康问题，大量长期饮用含有酒精的饮料会导致肝发生脂肪肝等病理损伤，引起酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)[1]。研究发现，肠道菌群可调节机体代谢脂质获得能量的效率，参与机体饮食环境改变所致食物代谢活动的改变，调节血脂水平变化及脂肪在肝等的积累过程[2]。研究发现，沉默信息调节蛋白1(sirtuin-1，SIRT1)是一种组蛋白去乙酰化酶，参与调解能量代谢等过程[3]；碳水化合物结合蛋白(carbohydrate element binding protein，ChREBP)是肝中调控葡萄糖代谢的一种重要转录调节因子，可激活糖酵解过程和脂质合成相关基因的转录，在酒精性肝病发展过程中具有重要作用[4]。双歧杆菌(Bifidobacterium，BIFI)作为人体肠道内的优势菌群之一[5]，是否能通过调节脂质代谢影响酒精性肝疾病的发生发展尚不清楚。本研究通过构建慢性酒精性肝损伤(chronic alcoholic liver injury，CALI)大鼠模型，旨在探讨BIFI对CALI大鼠肝损伤的保护作用并初步探讨其作用机制，为研究和开发防治酒精性肝损伤的治疗方法提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

70只清洁级SD大鼠，12周，体重180～210 g，购自上海西普尔-必凯公司【SCXK(沪)2013-0016】。在厦门大学附属第一医院实验动物中心统一进行常规饲养【SYXK(沪)-2013-0058】，均自由饮水饮食，1周后用于实验。所有实验均经本院动物实验伦理委员会批准(伦理批准号：2014-03)。

1.1.2 药物、主要试剂与仪器

双歧杆菌活菌胶囊(批号：S10960040)，购自丽江丽珠制药厂；美他多辛胶囊(批号：H20092458)，购自浙江震元医药公司；SIRT1抑制剂Tenovin-6(批号：HY-15510)，购自美国MCE公司；无水乙醇(≥ 99.7%，批号：20140903)，购自碧云天生物公司；4%多聚甲醛、苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染色试剂盒、戊二醛、BCA试剂盒、DAB显色试剂盒、蛋白提取试剂盒，购自上海生工生物技术公司；丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)试剂盒、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)试剂盒，购自碧云天公司；Anti-SIRT1(批号：ab189494)、Anti-ChREBP(批号：ab81958)、Anti-GAPDH(批号：ab9548)，羊抗兔二抗(批号：ab6721)，购自美国ABCam公司；石蜡烤片机，购自德国Leica公司；普通光学显微镜，购自日本Olympus公司；蛋白电泳仪、半干转膜仪，购自美国Bio-Rad公司等；全自动生化检测仪，购自美国BC公司。

1.2 方法

1.2.1 动物造模及给药

将70只SD大鼠随机分成以下7组，每组10只：(1)空白对照组：空白+生理盐水灌胃；(2)CALI组：酒精造模+生理盐水灌胃；(3)阳性对照美他多辛(metadoxine，META)组：酒精造模+90 mg/kg META灌胃给药；(4)-(6)BIFI低、中、高剂量组：酒精造模+500 mg/kg BIFI、1000 mg/kg BIFI、2000 mg/kg BIFI灌胃给药；(7)Tenovin-6组：酒精造模+2000 mg/kg BIFI+25 mg/kg Tenovin-6灌胃给药，灌胃容积为10 μL/g，每天1次，持续7 d。按照Lieber-DeCarli方法进行酒精造模[6]，前6周分别给予5%酒精灌胃，后2周给予8%酒精灌胃。8周后，给予大鼠常规麻醉处理，取腹主动脉血5 mL用于肝功能检测；立即取出大鼠肝，洗净后对称切半，一半切碎后分成两份，置于液氮中速冻，-80℃保存；一半置于4%多聚甲醛中固定，制备常规石蜡切片，用于HE染色和组织病理学观察。

1.2.2 生化指标检测

(1)各组大鼠肝功能检测：将1.2.1中血液标本静置30 min后，于3000 r/min条件下离心10 min，小心取出上层清液，一部分采用ALT试剂盒、AST试剂盒检测血液中ALT水平和AST水平。

(2)血清三酰甘油(triglycerides，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)水平检测：将(1)中血清样品置于全自动生化检测仪中测定血清TG和TC的含量。

(3)肝组织TG和TC含量的测定：将1.2.1中冷冻大鼠肝组织取出，制备匀浆液，3000 r/min条件下离心10 min，采用ALT试剂盒、AST试剂盒检测上清液中ALT水平和AST水平。

(4)肝组织病理形态变化观察：对1.2.1中大鼠肝组织切片脱蜡、水化后，按照HE染色流程进行染色，中性胶封片，置于光学显微镜下，观察大鼠肝组织形态。

(5)肝组织SIRT1、chREBP蛋白表达检测：取出适量冷冻大鼠肝组织，在液氮中研磨，加入1.2 mL蛋白裂解液，提取各组大鼠肝组织总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白总量。经聚丙烯酰胺十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)-凝胶电泳分离蛋白质，转印至PVDF膜上；5%脱脂奶粉，封闭1 h；分别加入一抗Anti-SIRT1、Anti-chREBP、Anti-GAPDH(1∶1000)，4℃孵育过夜；加入二抗(1∶5000)，室温孵育1 h。化学发光法进行检测，Tanon软件拍摄图像并进行分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行统计学分析，计量数据均采用平均数±标准差表示，行单因素方差分析。P< 0.05，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BIFI对CALI大鼠肝功能的影响

与对照组比较，CALI组大鼠肝组织中AST、ALT 活性明显增高，差异有显著性(P< 0.05)；与CALI组比较，BIFI低、中、高剂量组大鼠肝组织中AST、ALT 活性明显降低，差异有显著性(P<0.05)；与BIFI高剂量组比较，Tenovin-6组大鼠肝组织中AST、ALT 活性明显增高，见表1。

表1 BIFI对大鼠肝组织AST、ALT水平的影响Table 1 Effect of BIFI on AST and ALT levels in rat

注：与对照组比较，*P< 0.05；与CALI组比较，#P< 0.05；与BIFI-H组比较，※P< 0.05。

Note: Compared with the control group,*P< 0.05. Compared with the CALI group,#P< 0.05. Compared with the BIFI-H group,※P< 0.05.

2.2 BIFI对CALI大鼠脂质代谢的影响

与对照组比较，CALI组大鼠肝组织和血清中TG、TC 含量明显增多，差异有显著性(P< 0.05)；与CALI组比较，BIFI低、中、高剂量组大鼠肝组织和血清中TG、TC 含量明显减少，差异有显著性(P< 0.05)；与BIFI高剂量组比较，Tenovin-6组大鼠肝组织和血清中TG、TC 含量明显增多，见表2。

表2 BIFI对大鼠肝组织和血清中TG、TC水平的影响Table 2 Effect of BIFI on TG and TC levels in rat liver tissue and n=10,mmol/L)

注：与对照组比较，*P< 0.05；与CALI组比较，#P< 0.05；与BIFI-H组比较，※P< 0.05。

Note: Compared with the control group,*P< 0.05. Compared with the CALI group,#P< 0.05. Compared with the BIFI-H group,※P< 0.05.

2.3 BIFI对CALI大鼠肝组织结构的影响

组织病理学表现显示，对照组大鼠肝小叶形态完整，肝细胞排列紧密规则、无脂滴堆积，未见炎性细胞，肝组织结构正常。CALI组大鼠肝呈脂肪性病变，肝小叶结构不完整，肝细胞破碎、肿胀，排列疏松，出现大量脂滴和炎性细胞浸润，呈病理损伤状态。BIFI低、中、高剂量组大鼠肝组织损伤程度减轻，破碎和炎性肝细胞数量减少，肝细胞形态相对规则。Tenovin-6组大鼠肝呈病理损伤状态。(图1)

注：A：空白对照组；B：CALI组；C：META组；D：BIFI低剂量组；E：BIFI中剂量组；F：BIFI高剂量组；G：Tenovin-6组。图1 HE染色观察BIFI对大鼠肝组织结构的影响(n=10，×400)Note. A. Control. B. CALI. C. META. D. BIFI-L. E. BIFI-M. F. BIFI-H. G. Tenovin-6.Figure 1 Effect of BIFI on the liver tissue structure of rats by HE staining (n=10，×400)

2.4 BIFI对CALI大鼠SIRT1/ChREBP通路的影响

如图2所示，与对照组比较，CALI组大鼠肝组织SIRT1蛋白表达明显降低，ChREBP蛋白表达明显增高，差异有显著性(P< 0.05)；与CALI组比较，BIFI低、中、高剂量组大鼠肝组织SIRT1蛋白表达明显增高(P< 0.05)，ChREBP蛋白表达明显降低(P< 0.05)；与BIFI高剂量组比较，Tenovin-6组大鼠肝组织SIRT1蛋白表达明显降低(P< 0.05)，ChREBP蛋白表达明显增高(P< 0.05)，见表3。

注：A：空白对照组；B：CALI组；C：META组；D：BIFI低剂量组；E：BIFI中剂量组；F：BIFI高剂量组；G：Tenovin-6组。图2 BIFI对CALI大鼠肝组织SIRT1/ChREBP蛋白表达的影响(n=10)Note. A. Control. B. CALI. C. META. D. BIFI-L. E. BIFI-M. F. BIFI-H. G. Tenovin-6.Figure 2 Effect of BIFI on the expression of SIRT1/ChREBP protein in liver tissue of CALI rats (n=10)

组别GroupsChREBP/GAPDHSIRT1/GAPDH对照组Control0.53±0.092.12±0.41CALI组CALI2.29±0.48*0.36±0.07*阳性对照组META0.63±0.11*#1.11±0.09*#BIFI低剂量组BIFI-L2.02±0.13*#0.64±0.06*#BIFI中剂量组BIFI-M1.24±0.12*#0.89±0.13*#BIFI高剂量组BIFI-H0.65±0.11*#1.13±0.11*#Tenovin-6组Tenovin-60.94±0.13*#※0.88±0.12*#※

注：与对照组比较，*P< 0.05；与CALI组比较，#P< 0.05；与BIFI-H组比较，※P< 0.05。

Note: Compared with the control group,*P< 0.05; compared with the CALI group,#P< 0.05; compared with the BIFI-H group,※P< 0.05.

3 讨论

酒精是导致酒精性肝损伤(CALI)的关键致病因子，大量研究表明，饮用酒精量越大，饮酒时间越长，肝损伤程度越严重[7]。ALD肝损伤早期多呈现出脂肪肝症状、随着疾病严重程度的增加，依次进展为肝炎症、肝组织纤维化、肝硬化等，严重者导致大面积肝组织细胞坏死，甚至肝衰竭，威胁患者生命[8]。其中肝脂肪增多是ALD发生发展的重要原因之一[9]。很多医者认为，戒酒是改善酒精性肝病患者肝损伤的根本方法，是治疗CALI患者最基本的措施[10]。在酒精所致肝损伤过程中，首要发生的是脂肪性病变。本研究根据前人报道的方法，采用连续酒精灌胃的方式制备CALI模型大鼠，结果显示，连续灌胃8周后，CALI组大鼠肝组织中AST、ALT 活性明显增高，肝组织和血清中TG、TC 含量均明显增多，且肝组织肝小叶结构不完整，肝细胞破碎、肿胀，排列疏松，出现大量脂滴和炎性细胞浸润，呈脂肪性病变状态，表明CALI模型制备成功。

肠道菌群在人体能量代谢、营养吸收中发挥关键作用，肠道菌群的紊乱可导致一系列疾病，而合理增加有益菌群可改善机体代谢[11]。大量研究表明，采用益生菌预处理可减轻非酒精性脂肪肝患者的肝功能损伤[12-13]。Porras等[14]研究发现，槲皮素可通过调节肠道菌群失衡及相关的肝-肝轴激活，发挥对高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝的保护作用，提示肠道菌群可调节肝功能。Janssen等[15]进一步研究发现，肠道菌群的调节可有效减轻非酒精性脂肪肝小鼠肝中脂肪组织质量，减轻炎症反应，改善肝纤维化程度，提示肠道菌群对非酒精性肝脂肪性病变具有一定保护作用。本研究发现，与CALI组比较，BIFI低、中、高剂量组大鼠肝组织中AST、ALT 活性明显降低，表明BIFI具有保护慢性酒精所致肝功能损伤的功能。另外，与CALI组比较，BIFI低、中、高剂量组肝组织和血清中TG、TC 含量明显减少，破碎和炎性肝细胞数量减少，肝组织损伤程度明显减轻，表明BIFI具有改善慢性酒精性肝损伤过程中脂质堆积的功能，与Chen等[16]在高脂饮食诱导的脂肪肝大鼠中研究一致。进一步研究发现，BIFI对CALI大鼠脂肪堆积的抑制作用和对肝功能损伤的保护作用可被SIRT1抑制剂Tenovin-6特异性地抑制，提示BIFI对CALI大鼠脂肪代谢的促进作用和对肝功能损伤的保护作用可能与SIRT1通路有关。

SIRT1在哺乳动物体内广泛表达，通过调节组蛋白乙酰化/去乙酰化水平，调节DNA与组蛋白的结合状态，影响基因转录，在细胞凋亡、能量代谢、炎症反应、氧化还原平衡等生理过程中发挥重要作用[17]。Jeon等[18]发现，SIRT1在肥胖性脂肪肝小鼠肝组织中表达下调，敲除SIRT1可显著增加脂肪肝小鼠肝病变程度和炎症水平，提示SIRT1可能预防高脂饮食诱导的肥胖性肝损伤。另外Liangpunsakul等[19]发现，乙醇喂养小鼠可导致其肝中ChREBP表达上调，抑制其表达则可改善乙醇所致小鼠肝损伤。Gao等[20]研究发现，香石酸可通过促进SIRT1表达，抑制ChREBP表达抑制酒精性肝损伤大鼠肝组织中氧化应激和炎症反应，降低大鼠血脂水平，保护酒精所致大鼠肝损伤。以上研究表明，SIRT1/ChREBP在脂肪性肝损伤中发挥重要作用。本研究发现，与对照组比较，CALI组大鼠肝组织SIRT1蛋白表达明显降低，ChREBP蛋白表达明显增高，与过往文献报道一致，表明SIRT1/ChREBP参与酒精所致大鼠肝损伤过程。进一步研究显示，与CALI组比较，BIFI低、中、高剂量组大鼠肝组织SIRT1蛋白表达明显增高，ChREBP蛋白表达明显降低，表明BIFI具有激活SIRT1表达，抑制ChREBP表达的可能。同时，这种调节SIRT1、ChREBP蛋白的作用被SIRT1抑制剂Tenovin-6特异地抑制，提示BIFI可能通过促进SIRT1表达，抑制ChREBP表达，抑制肝中脂质合成。

综上所述，BIFI可能通过促进SIRT1表达，抑制ChREBP表达，减轻CALI大鼠体内脂质合成，实现对慢性酒精性肝损伤大鼠的肝保护作用。