N-乙酰半胱氨酸对2型糖尿病大鼠肝氧化应激及FoxO1活性的影响

雷少青，王雅枫，周璐，张元，夏中元，苏娃婷

(武汉大学人民医院麻醉科，武汉 430060)

糖尿病是一种以持续高血糖为主要特征的代谢紊乱性疾病，其控制不良往往会导致心脏、脑、肾、眼、周围神经等多种组织器官功能损害，因而被社会广泛关注。流行病学资料显示：近70%的2型糖尿病患者存在慢性肝损害，其中最为常见的是非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)[1-2]，但由于肝具有较强的代偿功能且早期肝损伤不明显，因而糖尿病所导致的肝病变未引起临床医师及患者重视。研究显示，NAFLD与糖尿病可相互促进，并形成恶性循环，从而加速疾病进展[3-4]。尽管糖尿病患者易发生肝损害的具体机制不详，但已有证据表明高血糖所导致的氧化应激是其发生发展的重要始发因素[5]。叉头状转录因子O亚型1(forkhead transcription factor of class O1)是机体调控代谢的重要因子，其活性受胰岛素负性调控[6]。在糖尿病状态下，FoxO1过度活化可增加脂肪酸的摄取及氧化，同时抑制葡萄糖氧化利用率，当脂肪酸摄入量超过细胞的代谢能力时，将导致细胞线粒体功能紊乱而产生过量ROS(reactive oxygen species)致细胞损伤[7-8]。由此可见，FoxO1过度活化也可能是糖尿病氧化应激的重要机制。尽管如此，目前关于氧化应激与FoxO1过度活化在糖尿病肝损害中的具体作用关系仍然不明。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一种含巯基的自由基清除剂，并是抗氧化剂谷胱甘肽的前体，因此被广泛用来去除氧化应激所产生的ROS[9]。本研究旨在观察2型糖尿病大鼠肝组织的抗氧化状态及FoxO1的活性，并观察抗氧化剂NAC干预对其的影响，以探究糖尿病相关肝损害的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

24只SPF级雄性SD大鼠，7～8周龄，180～220 g，由湖北省实验动物研究中心提供【SCXK(鄂)2015-0018】，饲养于武汉大学人民医院动物实验中心【SYXK(鄂)2015-0027】。

1.1.2 主要试剂与仪器

链脲佐菌素与N-乙酰半胱氨酸(NAC)购自美国Sigma公司；超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛和三磷酸腺苷(比色法)含量测定试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司；一抗FoxO1购自美国Santa Cruz公司；预染Marker、GAPDH、H3、Caspase-3与二抗购自美国Cell Signaling公司；全自动生化分析仪(日本东芝公司)；美国强生血糖分析仪。

1.2 方法

1.2.1 模型制作

SD大鼠以标准饮食适应性喂养1周后，按计算机产生的随机数列将大鼠分为正常对照组(C)、糖尿病组(D)及NAC治疗组(D+NAC)。D组与D+NAC组给予高脂饮食喂养4周后开始造糖尿病模型。造模前禁食12 h，腹腔注射小剂量STZ(25 mg/kg)，连续3 d血糖值超过11.1 mmol/L为2型糖尿病成功模型。D+NAC组大鼠灌胃给予NAC 1.5 g/(kg·d)[9]，C组与D组大鼠给予同体积生理盐水。C组大鼠给予标准饮食，D组与D+NAC组大鼠继续给予高脂饮食，持续8周。

1.2.2 标本收集与指标检测

(1)一般指标

试验期间，每周监测大鼠血糖、体重一次，NAC治疗后第4周与第8周分别记录24 h进食量与饮水量。实验结束时，记录体重、肝重，并计算肝重指数=肝重/体重×100%。

(2)样本收集

实验结束后，大鼠经戊巴比妥钠(65 mg/kg)麻醉及肝素抗凝后，处死大鼠，从下腔静脉收集血液，随后获取肝组织，所有标本(血浆与肝组织)于-80℃冰箱保存。

(3)血浆指标检测

全自动生化分析仪检测三酰甘油(triglyceride，TG)、血浆游离脂肪酸(free fat acid，FFA)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平；应用试剂盒检测血浆MDA水平，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

(4)肝组织氧化应激指标检测

将部分肝组织进行匀浆，提出上清液及BCA法测定蛋白浓度后，检测肝组织标本中的SOD、CAT、GSH-Px和MDA水平，所有操作按试剂盒说明书进行。

(5)肝组织ATP含量测定

ATP水平可以直接反映线粒体功能。将上述的肝组织上清液经BCA法测定蛋白浓度后，用试剂盒检测肝组织标本中的ATP水平，操作按试剂盒说明书进行。

(6)Western blot分析肝组织总蛋白中的Caspase-3及细胞质与细胞核中FoxO1蛋白表达水平

严格按照碧云天生物蛋白提取试剂盒说明书提取肝组织总蛋白及细胞质与细胞核蛋白，BCA法测定其蛋白浓度。上样量为50～100 μg，10%～12.5% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后转到PVDF膜；常温封闭2 h后，加入一抗Caspase-3(1∶1000, Cell Signaling)，FoxO1 (1∶500, Santa Cruz Biotechnology)，GAPDH (1∶2000, Cell Signaling)，H3 (1∶1000, Cell Signaling)，4℃孵育过夜；再次洗膜后加入二抗(anti-rabbit IgG，1∶10 000, Cell Signaling)中室温孵育2 h；按奥德赛 (Gene Company Limited) 操作人员手册扫描条带，分析并导出蛋白条带，计算目标条带灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较

如表1所示，在实验结束阶段，与C组相比，D组大鼠24 h进食量与饮水量、血糖水平及肝重指数明显增加，而体重明显减轻(P<0.01)。与D组比较，D+NAC组大鼠24 h进食量与饮水量均有减少(P< 0.05)，但血糖水平、体重及肝重指数未有统计学改变。值得注意的是，在本实验的前期研究中，我们未发现NAC干预对正常大鼠的一般情况有显著影响(结果未显示)，因此在后续实验中未检测C+NAC组大鼠相关指标的变化。

2.2 各组大鼠血浆TG、FFA、ALT、AST及MDA水平

如表2所示，与C组相比，D组大鼠血浆中TG、FFA、ALT、AST及MDA水平均显著增加(P<0.01)；与D组比较，D+NAC组大鼠血浆TG、FFA、ALT、AST与MDA水平均明显降低(P<0.05)，但仍明显高于C组(P<0.05)。

2.3 各组大鼠肝组织SOD、CAT、GSH-Px、MDA及ATP水平

如表3所示，与C组比较，D组大鼠肝组织中SOD、CAT与GSH-Px活性及ATP含量均显著降低(P<0.05)，而脂质过氧化物MDA含量明显增加(P<0.01)；与D组比较，D+NAC组大鼠SOD、CAT与GSH-Px活性及ATP含量均明显增加(P<0.05)，MDA含量尽管仍高于C组但显著低于D组(P<0.05)。

表1 各组大鼠一般情况Table 1 General characteristics of rats at the end of the study(n=8,

注：与C组比较,*P<0.05，**P<0.01；与D 组比较，#P<0.05。C：正常对照组；D：糖尿病组；D+NAC：糖尿病+N-乙酰半胱氨酸治疗组。(下表和图同)。

Note. Compared with group C,*P<0.05,**P<0.01. Compared with group D,#P<0.05. C: control group; D: diabetic group; D+NAC: diabetes with N-acetylcysteine (NAC) treated group.(The same in the following Figures and Tables).

表2 各组大鼠血浆TG、FFA、ALT、AST及MDA水平Table 2 Plasma levels of TG, ALT, AST and MDA in rats of each

表3 各组大鼠肝组织SOD、CAT、GSH-Px及MDA水平Table 3 The levels of SOD, CAT, GSH-Px and MDA in liver tissues of rats in each group(n=8,

2.4 各组大鼠肝组织Caspase-3表达水平

如图1所示，与C组比较，D组大鼠肝组织Caspase-3表达水平显著降低(P< 0.01)，提示糖尿病肝组织凋亡水平增加；抗氧化剂NAC治疗后显著降低Caspase-3表达水平。

图1 各组大鼠肝组织Caspase-3蛋白表达水平Figure 1 Caspase-3 expression in liver tissues of rats in each group

2.5 各组大鼠肝组织FoxO1活性水平

如图2所示，与C组比较，D组大鼠肝组织细胞质成分中FoxO1表达显著降低，而细胞核中FoxO1表达显著增加(P< 0.01)，提示糖尿病肝组织FoxO1活性显著增强；抗氧化剂NAC治疗后显著降低FoxO1活性水平。

图2 各组大鼠肝组织细胞质与细胞核中的FoxO1蛋白表达水平Figure 2 FoxO1 expression in cytoplasm and nucleus of liver tissues of rats in each group

3 讨论

现代生活方式和饮食习惯使得糖尿病及肥胖人群不断增多，临床上糖尿病相关的肝损害也越来越常见[10]。糖尿病状态下糖利用障碍，而脂肪动员代偿性增加，使得血浆游离脂肪酸增多，从而对机体产生毒性作用。肝能通过促进脂肪酸氧化和转化为甘油三酯储存在肝细胞内，从而适应糖尿病高脂质环境，这一方面导致肝组织氧化应激增强，另一方面致使肝细胞甘油三酯堆积而产生脂肪变性[11]。随着糖尿病的进展，肝功能逐渐受损，导致胰高血糖素等激素灭活减少、胰岛素抵抗加重、白蛋白合成障碍等一系列病理变化，从而形成恶性循环，最终加速了糖尿病及肝病变的进展[12]。

本研究采用高脂饮食与小剂量STZ腹腔注射诱导2型糖尿病大鼠模型，实验中糖尿病大鼠出现典型的“三高一少”临床症状，同时大鼠还表现为肝功能、线粒体功能与血脂异常，具体表现为ALT、AST、ATP、FFA及 TG水平均明显增加。此外，糖尿病大鼠肝组织caspase-3表达水平增高，进一步发现血浆和肝组织中脂质过氧化产物MDA浓度显著上升，这提示肝凋亡亡及氧化应激水平增加。NAC是目前较为常用的一种抗氧化剂，在我们前期研究中，其灌胃剂量在每日1.5 g/kg持续4周时可有效降低机体的氧化应激水平[9]，并能减轻糖尿病心肌功能紊乱及缺血后再灌注损伤[13]。在本研究中，我们应用NAC治疗8周后，ALT、AST、FFA、TG、ATP及调亡水平均显著降低。这表明抗氧剂NAC可部分抑制2型糖尿病大鼠肝组织氧化损伤、线粒体与肝功能减退及脂质异常代谢。

目前关于糖尿病导致肝损害的具体机制尚未完全阐明，但大量临床研究发现活性氧自由基(ROS)增多被认为是NAFLD的始发因素和中心环节[5, 14]。SOD、CAT及GSH-Px是机体最为重要的内源性抗氧化酶，其活性能反映机体的抗氧化能力。本研究发现2型糖尿病大鼠肝组织中SOD、CAT及GSH-Px活性均显著降低， NAC干预明显升高了这三种抗氧化酶的活性。这提示NAC具有增强2型糖尿病大鼠肝组织内源性抗氧化能力的作用，这可能是其减轻糖尿病肝损害的有关机制。

FoxO家族是近年研究的一个热点，其在调控细胞周期、氧化应激、能量代谢等方面具有重要作用。目前已发现四种FoxO家族成员：FoxO1、FoxO3、FoxO4及FoxO6。其中，FoxO1在调节代谢方面尤为重要，其活性受胰岛素负性调节[6]。在糖尿病状态下，胰岛素绝对或相对不足均会导致FoxO1活性增强，从而增加脂肪动员，致使FFA浓度显著增加，过量的FFA进入肝并超过肝的氧化能力，造成大量TG在肝中蓄积形成脂肪肝。此外，过量的FFA也会抑制胰岛素的释放、干扰胰岛素的功能[15]，这会加重糖尿病，因而形成恶性循环。这提示糖尿病相关肝损害的发生和发展与FoxO1活性显著增加密切相关。由于高血糖与高血脂均可以引起机体氧化应激的增强，因而在本实验中我们特别检测了抗氧化剂NAC对肝FoxO1活性的影响。我们发现2型糖尿病肝组织FoxO1活性显著增强，而抗氧化剂NAC可以显著抑制其活性。这表明糖尿病肝FoxO1活性增强与氧化应激有关，通过减轻糖尿病氧化应激从而抑制FoxO1活化的措施或许是减轻糖尿病肝损害的重要途径。

综上所述，抗氧化剂NAC可以减轻实验性2型糖尿病相关肝损害，其机制可能与其增强机体抗氧化能力、减少血脂代谢与线粒体功能异常并抑制FoxO1过度活化有关。本研究初步探讨了抗氧化剂对2型糖尿病相关肝损害中氧化应激及FoxO1的影响，以期为糖尿病相关肝损害临床药物的研发提供理论依据。