桶装水铜绿假单胞菌污染原因及检测方法

周 鹤 张国利 傅志丰 许文蓓

（1.九江市食品药品检验所 江西九江 332000；2.九江市食品检验检测中心）

1 前言

铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）又称绿脓杆菌（以下简称PA），是一种非发酵革兰氏阴性杆菌，广泛存在于水、土壤、空气及动物机体和皮肤中，对紫外线、消毒剂等不良环境的抵抗力强，是一种重要的食源性条件致病菌，正常人不易感染，然而对于一些特殊人群，如术后病人以及婴幼儿，如果接触该菌易导致急性肠道炎、脑膜炎和败血症等疾病[1]，严重威胁人们的身体健康。

桶装水是指采用自来水或地下水，经过现代工业技术加工的纯净水或矿泉水。近年来，随着我国经济的发展，人们对食品的消费要求也越来越高，桶装水因其购买、饮用便捷的特点，越来越受到大众的欢迎。据统计，2010年我国桶装水消费规模为2.9×1010元，2017年增长至7.6×1010元，市场规模增加了1.6倍[2]。然而，在发展的同时，桶装水也存在众多问题，近年来有关PA污染水的报道逐渐增多。2019年1月，《消费者报道》显示，2014年至2018年，国家及省级食品药品监督管理局共抽检出2 350批次不合格的桶装水，其中，1 551批次检出PA，占比达60.8%[3]。2018年，九江市也抽检桶装水25批次，其中有13批次PA不合格。因此，PA是桶装水最突出的质量安全问题。本文就其污染原因进行阐述，并简要介绍了当前水中PA检测常用的几种方法，为生产实践提供理论技术支撑。

2 PA污染原因

2.1 水源污染

水源污染可能是桶装水受PA污染的根本原因。桶装水主要以自来水、井水或江河湖泉水作为水源。近年来，我国经济在高速发展的同时，存在各种工业废水和生活污水未处理达标就直接排放至水体的现象。据马群飞等[4]的调查显示，福建省投入生产的80处饮用天然矿泉水水源中，有18处检出了PA，检出率为23.08%。邓梅清等[5]对南方地区45份进行检查，也发现有11份检出PA，高于成品水的14.4%，其中在成品水检出的4家中有3家水源受到污染。如果水源受到污染，后续工艺又无法将其去除，就容易产生持续性污染。

2.2 生产过程控制有待提高

桶装水的生产工艺流程为：水源水→粗滤→精滤→去离子化→[离子交换、反渗透（适用于纯净水）及其他加工方法]→配料（适用于其他饮用水）→杀菌→灌装封盖[瓶（桶）及其盖的清洗消毒]→灯检→成品。在生产过程中仪器设备污染、杀菌工艺参数设置不当、灌装车间环境不达标、人员操作不规范等都有可能导致产品检测结果不合格。其中，前3点是生产过程中造成污染的主要因素。

2.2.1 仪器设备污染

水处理系统并不是完全密封的，水罐、砂罐和活性炭罐都通过呼吸器与外界相通，细菌很容易侵入管道系统。PA对环境耐受力强，迅速地黏附在水生产所用的器具如储水罐、管道、灌装机、滤膜和增压泵上，简单的冲洗、常规的消毒技术难以对其清除。陈水仙等[6]对福建某企业桶装水PA污染进行调查发现，蓄水池中含有大量的PA，是该企业的原始污染源。在潮湿的环境下PA更易繁殖，随着生产线进入下一环节，并可能蔓延至全工序的管道、设备，造成交叉污染。除此之外，部分企业对石英砂、活性炭等过滤装置长期不清洗消毒，精滤过程的滤膜不及时更换，有的长达5年未做任何清洗或更换，一旦污染难以消除。

2.2.2 杀菌工艺参数设置不当

目前，桶装水常采用通臭氧的方式消毒杀菌，通入臭氧能有效降低水中PA的浓度。然而，如果水中溴化物浓度过高，过量臭氧的通入将导致溴酸盐超标。张永清等[7]报道，随着臭氧浓度和溴离子浓度的增加，水中溴酸盐生成量增加；当臭氧质量浓度为0.4 mg/L、作用时间为5min时，选用的3种矿泉水的溴酸盐含量均大于国标要求10 μg/L。因此，企业为避免溴酸盐超标，必须降低臭氧的投加浓度和接触时间，而PA对消毒剂的抵抗力远大于其他微生物[8]，当水中PA含量较高时，容易造成杀菌不彻底的现象。

2.2.3 灌装车间环境不达标

《饮用水的生产许可证审查细则》对桶装水的生产环境要求做了具体规定：灌装车间空气洁净度须达到10 000级且局部应达到100级，或整体洁净度达到1 000级，然而许多企业空气清洁度难以持续保持。另外，水生产车间环境潮湿、常有积水，容易滋生PA，并通过罐装进入水中。汪华等[9]调查了衡阳市周边43家桶装饮用水工厂灌装间及其他主要生产环节PA污染情况，发现罐装车间普遍存在污染，PA检出率为83.7%，显著高于其他生产环节。

2.2.4 人员操作不规范

生产人员如果没有养成一个良好的操作习惯，违反规定洗手、更衣、消毒，或者手直接与水或者包装材料接触，都可能将PA带入产品中。由于PA对营养要求不高，在桶中繁殖更容易导致产品不合格。

2.3 包装材料清洗消毒不彻底

包装材料清洗消毒不彻底是桶装水受污染的又一重要因素。目前，生产企业一般对水桶进行回收再利用，但桶的特殊构造，不利于清洗和消毒，加上大部分企业缺乏清洗水桶的专用设备，采用人工进行清洗。在灌装前如消毒剂浓度过低或消毒时间不够，或消毒方法不当，不能有效地杀灭微生物，都可能导致桶内PA残留造成交叉污染。钟菲菲等[10]对水源、生产工艺、储存容器和生产环境等环节进行分析，结果显示清洗消毒的水桶是成品水PA污染的原因。另外，有些小企业生产工艺落后，仍手工灌装封盖，也可能使包装材料受到污染。

2.4 企业食品安全意识不强，出厂检验如同虚设

桶装水生产工艺较简单，且运输成本高、保质期短，因此绝大多数企业分布在各市县，以所在行政区内的市场为主。很多企业都是中小型企业，设备简陋，条件粗放，检验人员技术能力有待完善，造成出厂检验如同虚设，无法发现产品质量问题，部分企业产品甚至未经检验直接流入市场，造成一定的安全隐患。

2.5 运输储藏控制不当

桶装水桶盖的材料来源广泛，很多企业为了节约成本，采用回收的废旧聚乙烯（PE）材料制作，造成桶盖质量欠佳，弹性和密封性差，在运输、流通过程中易造成提拉松动而漏水，产品易受到空气中PA的污染。另一方面，桶装水一般有数月的保质期，企业刚生产的水中无铜绿假单孢菌或有极少含量，但在运输储藏过程中，尤其是夏秋季节（温度较高，适合铜绿假单胞菌生长），迅速自行增殖至1×104CFU/mL，造成产品饮用水的不合格[11]。

3 铜绿假单胞菌检测方法

水中铜绿假单胞菌的检测方法主要有传统培养法和新兴快速检测方法2类，其中传统培养法主要是GB 8538—2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》[12]中的滤膜法；新兴快速检测方法主要包括PCR法和环介导等温扩增法（LAMP）等。传统培养法实用性、准确性强，是国标通用的方法，但存在培养时间长的问题，且后续生化试验烦琐，不能实现批量产品快速检测；新兴快速检测方法快速、特异性强、灵敏度高、简便省时，然而也会产生假阳性的结果。

3.1 国标滤膜法

国标滤膜法是通过一定的培养，观察微生物的形态特征，将疑似菌落进行生化鉴定实验以确定结果。该方法实验条件要求不高，可以较直观地观察结果，适合基层实验室检测。具体操作过程为：将250mL水样用0.45 μm滤膜过滤，然后将滤膜贴至CN琼脂平板上，于36℃培养48 h后对结果进行观察。铜绿假单胞菌在CN平板上有3种形态：（1）蓝色或绿色菌落，按照GB/T 8538—2008《饮用天然矿泉水检验方法》[13]的方法可以直接判定检出，然而现行国标需进行绿脓菌素验证；（2）产荧光非蓝绿色菌落，需进行产氨试验，若产氨实验为阳性，则判定样品为阳性；（3）红褐色不发荧光菌落，此时需进行氧化酶试验、产氨试验和金氏B试验，如三者均为阳性，则样品为阳性。

3.2 PCR法（聚合酶链式反应）

PCR技术是在体外合适条件下，以DNA为模板，以一对人工合成的寡核苷酸为引物，在耐热DNA聚合酶作用下特异性扩增目的DNA片段的技术。应用PCR技术检测食源性致病菌分为常规PCR、实时荧光定量PCR、多重PCR等，为了提高检测灵敏度，可采用一定的增菌方式提高目标DNA片段的浓度。张淑红等[14]建立了常规PCR技术检测桶装水铜绿假单胞菌的方法，该方法包括过滤、增菌、过滤、提取DNA、电泳等步骤，整个操作过程仅约需要22 h，然而无法区分活细菌和死细菌，容易造成假阳性。为了克服这个缺点，陆星羽等[15]添加10μg/mL叠氮溴乙锭（EMA），既能有效抑制死菌PCR又不影响活菌PCR，进而实现了对水中活菌的检测。相比常规PCR法，荧光定量PCR技术在反应体系中加入荧光基团或染料，通过荧光信号的强弱反映扩增过程中模板浓度变化，具有更强的检测灵敏度和特异性。杨滴等[16]建立实时荧光定量PCR法检测矿泉水中的铜绿假单胞菌，根据外毒素A基因片段设计了一对特异性引物和一个TaqMan探针，特异性较好，检测灵敏度为1×103CFU/mL。Ezra Orlofsky等[17]采用MPN 计数结合q-PCR对污水中铜绿假单胞菌落进行检测，检测灵敏度提高至5 CFU/L。

3.3 LAMP检测法

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是由 Notomi等[18]开发的新型核酸扩增方法。该方法成本低，可在短时间内完成扩增，省时且无需大型专业设备，只需一台温控设备，是继PCR法后倍受青睐的检测技术。刘芳等[19]以基因ETA为靶基因，针对铜绿假单胞菌6个区域设计引物，建立水中铜绿假单胞菌的LAMP法，发现该法与传统培养法检验结果一致，但检验时间只需2h，并且可通过目测反应体系浊度变化或显色反应对结果进行判断。曹科峰等[20]以gbca基因为模板，采用电脑在线设计引物，利用反应体系的颜色变化及琼脂糖凝胶电泳的差异，建立了铜绿假单胞菌的LAMP检测法，与PCR法相比，检测灵敏度提高了约9倍。

4 结语

桶装水铜绿假单菌污染问题与人们的生命健康息息相关，对其控制须从水源保护、加强生产流通各环节的质量控制做起。监管部门应加大对桶装水的抽检力度，尤其是夏秋季节，要采用科学准确的方法进行检验，及时发现微生物污染情况，保证消费者的饮水安全。