1例猪瘟病毒RT-PCR检测方法的建立

孟莉

（重庆三峡职业学院 重庆 404001）

1 前言

猪瘟是目前危害养猪产业的一种主要传染病，也是给我国养猪业带来严重威胁的一种疾病，健康猪在感染了猪瘟病毒（CSFV）后临床表现多为发热、食欲减退、精神不振、咳嗽、结膜炎以及围产期死亡、流产等[1]。

猪瘟的病原体是CSFV，它属黄病毒科瘟病毒属，是一种有囊膜的正链核糖核酸（RNA）病毒[2，3]。 目前，CSFV诊断研究已深入到分子水平，用RT-PCR方法能快速、准确地检测出猪瘟病毒。CSFV基因组长约12.5 kb，含有一个开放性阅读框架（ORF），这个ORF翻译成含3 898个氨基酸残基的蛋白。蛋白的顺序为 Npro、C、Erns（E0）、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B，其中，C、E0、E1 和 E2 为结构蛋白，其余为非结构蛋白，E0和E2最具有免疫防制研究价值。E2是CSFV的主要免疫原，它与羊边界病毒（BDV）、牛病毒性腹泻（BVDV）都存在较强的交叉免疫反应。

2 材料和方法

2.1 猪瘟病料和标准毒株

2.1.1 猪瘟病料

取疑似猪瘟的淋巴结病料13份，病料来自重庆万州、开县、梁平、云阳、城口等地猪场。

2.1.2 细胞和猪瘟标准毒株

猪肾细胞（PK-15）系、猴肾上皮细胞（Marc-145）、乳仓鼠肾细胞（BHK-21）（西南大学畜牧兽医学院动物生物技术重点实验室）；CSFV标准株（中国兽医药品监察所）；猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）疫苗、口蹄疫病毒（FMDV）疫苗、猪细小病毒（PPV）（中牧实业有限公司）；伪狂犬病毒（PRV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、圆环病毒2型（PCV2）（武汉科前动物生物制品有限责任公司）。

2.2 仪器

凝胶成像系统（BIORAD，USA）；PCR 仪（C1000 Touch）；电泳槽（BIORAD，USA）；电泳仪（BIORAD，USA）；冷冻离心机（BIORAD，USA）。

2.3 主要试剂

RNA提取试剂Trizol（上海生工生物工程有限公司）；Ex Taq 酶（5 U/μL）、三磷酸脱氧核糖核苷 dN TP（2.5 mmol/L）、PCR Mix（2.5 mmol/L）、DNA Maker DL2000（分子量分别为 100bp、250bp、500bp、750bp、1 000 bp、2 000 bp）、二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理水（大连宝生物工程有限公司）；凝胶电泳试剂Tris、乙二胺乙酸（EDTA）（上海生工）；其他试剂均为国产分析纯。

2.4 方法

本试验13份病料为试验材料，以接种了猪瘟毒株CSFV的PK-15猪肾细胞系为阳性对照，以未接种猪瘟毒株CSFV的PK-15猪肾细胞系为阴性对照，设计试验。

2.4.1 引物设计

根据NCBI公布的猪瘟病毒石门株的E2基因序列，设计合成1对检测猪瘟病毒E2基因部分片段的RT-PCR引物。上游引物CSFV Pf：5’-ATCGACC AATGAGATAGGGCTACTC-3’，下游引物 CSFV Pr：5’-CACCTTGACAGTCCTGTTACCGATC-3’预期扩增的片段大小756 bp，送上海生工合成，用二次蒸馏水稀释，-20℃冻存备用。

2.4.2 猪瘟病毒RNA提取

疑似猪瘟病料组织RNA的提取：（1）取淋巴结组织块在液氮中将病料研磨成粉状，将粉末转移到2 mL离心管中。每100 mg组织加1.0 mL Trizol，室温放置5 min，使其充分裂解。（2）12 000 r/min离心10 min，弃沉淀。 （3）加氯仿 200 μL，振荡混匀，静置15 min。（4）小心吸取上层液体于新的离心管中，加等量预冷异丙醇600 μL，混匀，冰上放置9 min。（5）12 000 r/min、4℃离心 10 min，弃上清，RNA 沉于管底。（6）用1 mL灭菌蒸馏水配制的75%乙醇温和震荡悬浮沉淀，10 000 r/min离心10 min，小心弃去乙醇，室温干燥沉淀 5～8 min。 （7）加 50 μL 无 RNA酶（RNase-free）水溶解沉淀，-70℃保存备用。

2.4.3 RT-PCR扩增猪瘟病毒

以下游引物CSFV Pr为引物，从提取的病毒总RNA中进行反转录合成互补基因（cDNA）。反应在PCR仪上进行，最佳反应条件为：反转录56℃、50min；预变性 94℃、10 min；变性 94℃、40 s，复性 55℃、35 s，延伸 72℃、35 s（25个循环）；终延伸 72℃、10 min。

2.4.4 凝胶电泳和结果观察

配制1.0%的琼脂糖凝胶，将凝胶放入1×TBE电泳缓冲液的电泳槽中，取10 μL的PCR产物同2 μL的 6×Loading buffer（1 mL 6×Loading buffer混有25 μL的花青素）混匀上样，所用Marker为2kplus。上样后，凝胶于1×TAE缓冲液中，120V电泳40 min。电泳结束后使用BIORAD凝胶成像分析系统拍照分析。

3 结果

3.1 接种CSFV的PK-15细胞RT-PCR检测结果

从接种CSFV的PK-15细胞中提取总RNA，设计引物进行RT-PCR反应，结果只扩增出一条大小约为756 bp的片段，与预计的目的片段一致，通过对各种反应条件进行优化，最终确定反应条件。

3.2 猪瘟RT-PCR特异性试验结果

特异性试验的电泳结果显示，不能从BVDV、PRRSV、PRV、PPV、PCV2和 PK-15 基因组中扩增出相应片段，只能特异性地扩增出CSFV相应的目的片段，与预期结果完全一致，表明该引物及方法具有比较好的特异性。

3.3 猪瘟RT-PCR敏感性试验结果

将CSFV总RNA稀释，再按以上方法进行RT-PCR反应。结果表明，可检测到的RNA最低量为20 ng。

3.4 猪瘟RT-PCR重复性试验结果

重复试验结果显示，多次重复进行RT-PCR试验都能扩增出目标片段，说明该试验建立的方法具有较好的重复性。

3.5 猪瘟RT-PCR产物的序列测定与比对

将上海生工生物有限公司的测序结果利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）网站上提供的核酸比对软件Blastn对测得的序列进行比较。结果表明，测得序列与GenBank上登录的核酸序列比对，同源性达到97%，说明扩增得到的基因序列就是目标CSFV的部分基因序列片段，即本试验方法有较好的特异性。

3.6 临床样品的检测结果

对13份疑似猪瘟病料进行RT-PCR分析，RTPCR检出阳性病料12份，扩增特异性条带大小为756 bp，与目标条带近似，阳性检出率为92.3%。阳性对照扩增条带与目标条带相似，约为756 bp，阴性对照没有扩增出片段。

4 结论

本试验设计了1对检测猪瘟病毒E2基因的RTPCR引物，建立了1例新的猪瘟病毒CSFV RT-PCR检测的方法。试验结果表明，该方法检测猪瘟病毒较准确有效。本文设计的引物扩增的目标片段为756bp，降低了非特异性片段出现的概率，从而降低了假阳性出现的概率，使试验结果更加准确。

5 讨论

（1）由于猪瘟为RNA病毒，而RNA又容易受环境中RNA酶降解，本试验所用的一步法RT-PCR有助于减少残余污染，可以得到更高的灵敏度。同时，一步法简化了试验操作步骤，缩短了检测时间。因此，本试验建立的一步法RT-PCR为猪瘟病原检测和诊断提供了一种简便、经济、快速的手段。

（2）本试验结果中RT-PCR结果片段未在同一条水平线上，可能是电泳时电压不稳定或电泳液不均匀造成的，可进一步改进电泳条件。

（3）目前已经报道的猪瘟一步法RT-PCR检测的目标片段偏小。吴鑫[4]对猪瘟病毒5’端非编码区保守序列设计引物，扩增产物长267 bp。向智龙等[5]根据猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列，设计并合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物，扩增的片段大小267 bp。已经报道的目标片段一般为200～300 bp左右，扩增片段太小导致RT-PCR结果容易出现假阳性[6]。本文设计的引物扩增的目标片段较长，为756 bp，降低了非特异性片段出现的概率，从而降低了假阳性出现的概率，使试验结果更加准确。本试验结果可为猪瘟病毒的鉴定[7]、病料的检测和流行病学调查提供一定的技术依据。