七类常见抗菌药耐药机制及耐药基因国内流行现状

韩天飞，刘 娜，张青青，赵建梅，李月华，黄秀梅，王 琳，王 娟，赵 格，刘俊辉，王君玮，曲志娜，祁克宗

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.安徽农业大学兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室，安徽合肥 230036）

抗菌药对畜禽细菌性疾病具有预防和治疗作用并能促进动物生长，因此广泛用于畜牧生产活动中。2013 年，我国生产和使用抗菌药就分别达到24.8 万t 和16.2 万t，其中约52%是用于畜牧养殖业[1]。抗菌药大量使用导致细菌耐药性问题变得日益严峻，根本原因是耐药基因在环境选择压力下的产生和扩散。2009 年7 月，国际抗菌药耐药基因数据库（antibiotic resistance genes database，ARDB）已收录了23 137 条抗菌药耐药基因序列，包括380 种耐药基因亚型，涉及249 种抗菌药物、267 个菌属、1 737 个菌种、632 个细菌基因组、2 881 个耐药基因载体[2]。耐药基因可通过质粒、整合子、转座子等移动元件在不同细菌间传播，也可以在动物、人和环境之间传播。细菌一旦获得了耐药基因，就可以使相应的抗菌药失效，而当细菌获得多种耐药基因时，就会使得该细菌引起的疾病变得难以救治。抗菌药耐药性问题已变得十分严重，而深入研究抗菌药耐药机制、了解耐药基因特性是遏制细菌耐药的基础工作。本文将对常见的抗菌药耐药基因进行综述，以期为细菌耐药监测与控制提供参考。

1 β-内酰胺类

β-内酰胺酶是β-内酰胺类抗菌药最常见的耐药因素。细菌通过表达β-内酰胺酶消减了β-内酰胺类抗菌药的杀菌作用，从而对此类抗菌药物产生耐药性。

目前，已报道的β-内酰胺酶主要包括青霉素酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBL）、头孢菌素酶（AmpC）、金属β-内酰胺酶（MBL）和碳青霉烯酶（KPC），其中产ESBL 菌广泛流行。CTX-M 型产ESBL 菌主要是位于质粒上的CTX-M 型（p-CZTX-M）耐药基因编码而成的。根据氨基酸的结构可以将CTX-M 型分为5个 大 群：CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9 和CTX-M-25。在最近的研究中还发现有CTX-M-74 和CTX-M-75 两个群[3]。近年国内主要流行CTX-M-1 群和CTX-M-9 群。来源于禽源、猪源、人源、食源、伴侣动物以及环境中的耐药菌主要含有的CTX-M 型是CTX-M-1 群和CTX-M-9 群[4-6]。

目前国内CTX-M 型产ESBL 菌逐渐增多并成为主流趋势，其原因很可能与多种携带此类耐药基因的质粒有关。在动物源大肠杆菌中分离得到了多种携带CTX-M-14 的质粒，分别为lncK、IncH12、IncH11、IncN、IncF1B、IncF 和Incl1[4]。TEM 型β-内酰胺酶的耐药基因总体呈现检出率高、亚型多样的特点。舒刚等[7]在2006—2012 年四川、重庆患病猪、鸡、鸭和奶牛的大肠杆菌中检测出blaTEM，检出率高达84.09%。TEM 亚型通常是由TEM-1、TEM-2 突变而来，在国内已报道的有TEM-1、TEM-2、TEM-7、TEM-8、TEM-9、TEM-116、TEM-135、TEM-151。另外，碳青霉烯酶类的耐药基因在国内逐渐有零星报道，虽未产生重大影响，但需要时刻监测。

2 喹诺酮类

喹诺酮类抗菌药的耐药机制主要通过抑制DNA 解旋酶和拓扑异构酶，从而干扰细菌DNA复制和转录的过程，包括两类基因突变和质粒介导的耐药基因的获得。

第一类是DNA 回旋酶中gyrA和gyrB编码的A 亚基和B 亚基发生突变[8]。gyrA编码的氨基酸Ala67-Gln106 和gyrB编码的氨基酸Asp426-Lys447 区域称为喹诺酮抗性决定区（QRDR）。在此区域中，突变最常出现在密码子83 和87 处。该活性部位的突变可能会改变喹诺酮类药物与该部位的结合，从而降低对喹诺酮类药物的敏感性。国内有研究[9]发现，gyrA基因第83 和87 位点氨基酸共同突变的突变率最高达到69.25%，并且当第83和第87 氨基酸位点同时突变时，大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药明显增强。

第二类是拓扑异构酶IV 中分别由parC和parE编码的C 亚基和E 亚基发生突变[8]。发生parC或parE突变不会产生高水平的喹诺酮耐药，但是当gyrA发生突变并伴随着parC或parE发生突变则可以产生高水平的喹诺酮耐药现象[10]，可以看出gyrA突变对于引起喹诺酮耐药起到十分重要的作用。此外，相比其他喹诺酮类耐药机制，质粒介导的喹诺酮耐药性（PMQR）为低水平的耐药。这种质粒介导的耐药机制包括：保护DNA 免受喹诺酮结合的Qnr 样蛋白，修饰某些AAC（6'）-Ibcr 乙酰转移酶以及主动外排泵蛋白。

虽然喹诺酮耐药性主要是细菌基因组突变的结果，但是PMQR 已经越来越多地在肠杆菌科中被报道：医院和养殖场中主要流行的是qnrS和qnrB[11-13]；oqxAB最早在耐喹乙醇的大肠埃希菌的质粒pOLA52 中被发现，国内检测结果发现其广泛存在于大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中[14]；另外aac（6'）-Ib-cr基因在大肠杆菌和沙门氏菌中的检出率也在持续升高，已具有广泛流行的趋势。不断增加的研究证据表明，PMQR 介导的耐药正在向高水平耐药发展。

3 氨基糖苷类

氨基糖苷类抗菌药自20 世纪40 年代发现以来，对大多数革兰阳性菌和革兰阴性菌引起的疾病都有很好的疗效，因此在医学临床、兽医学和畜牧养殖业得到广泛应用。该类药物的耐药机制主要有两种：第一种是氨基糖苷类修饰酶对抗菌药的修饰作用。该修饰酶根据反应类型的不同可以分为3 种：N-乙酰转移酶（N-acetyltransferases，AAC）、O-核苷转移酶（O-nucleotidyltransferase，ANT）和O-磷酸转移酶（O-phosphotransferases，APH），在细菌的染色体和质粒上均有发现。

第二种是外源性16SrRNA 甲基化酶通过甲基化细菌16SrRNA 中A 位点的特定核苷酸，使氨基糖苷类药物不能与之结合，从而产生耐药，这是一种由质粒介导的耐药机制[15]。目前已发现11 种外源性16SrRNA 甲基化酶。

国内引起氨基糖苷类耐药的主要机制是修饰酶对抗菌药的修饰作用，其中以aac（6'）-Ib/Ibcr、aac（3）-Ⅱ、aph（3'）-I为主要流行型[16-19]，检出率较高；相比前者，外源性16SrRNA 甲基化酶的相关耐药基因的流行程度相对较低，检出率普遍低于10%[17-19]，流行型为armA和rmtB。

4 磺胺类

磺胺类抗菌药通过干扰细菌内叶酸合成，从而达到抑菌目的。细菌通过产生低亲和力的二氢叶酸合成酶以获得耐药性，而sul1、sul2和sul3可以提高这种酶的表达，并随着质粒、转座子及整合子/基因盒系统等元件扩散[20]。另外，甲氧苄啶（TMP）是一种人工合成的叶酸结构类似物，是细菌二氢叶酸还原酶（DHFR）的竞争抑制剂。TMP 和磺胺类药物联合使用可以更加有效的起到杀菌、抑菌的作用，但同时也产生了赋予TMP 抗性的dfr基因。根据dfr基因的尺寸和结构将其分为两大类：dfrA和dfrB[21]。

在辽宁、贵州、福建、广东、江西和江苏等地区都检测出了sul1、sul2和sul3[22-25]。无论在猪源还是禽源中，sul2的检出率最高超出70%，sul1次之，sul3只在部分地区检出率最高，而dfrA和dfrB的检出率相对较低。

5 四环素类

四环素类药物是广谱抗菌药，在临床中被广泛用于治疗人和动物的细菌性感染，在一些国家常被用作动物促生长剂。四环素与细菌的核糖体结合，从而干扰细菌蛋白质的翻译来发挥抗菌药的作用，其外排泵蛋白和降解酶的出现使得细菌对四环素类抗菌药产生耐药性[26]。

根据四环素耐药基因命名中心（https://faculty.washington.edu/marilynr/）发布的信息可知，在大肠杆菌中存在13 种四环素耐药基因：分别是9 种四环素外排基因tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（E）、tet（G）、tet（J）、tet（L）和tet（Y），3 种核糖体保护蛋白基因tet（M）、tet（W）和tet（32）和1 种编码氧化还原酶使四环素失去活性的基因tet（X）。在近年国内的报道中，前两种机制是细菌对四环素类抗菌药产生耐药性的主要因素。

四环素耐药基因的广泛分布与其通过质粒传播的方式密切相关。程于梦等[27]在鸡源葡萄球菌中发现了携带cfr与tet（M）基因的质粒STR-9，荆炜[28]在肺炎克雷伯菌和大肠杆菌中发现tet（A）基因突变体都位于质粒上。另外，有研究发现四环素耐药基因往往不是单独存在，多种并存的情况更为常见。研究人员对783 株大肠杆菌所携带的基因类型数量进行统计，发现4重携带最多（34.2%），其次是3 重（21.1%）和5 重（26.4%）；并且米诺环素和替加环素的耐药性与基因携带数量有一定关联，携带5 重和6 重基因的耐药率明显比其他重数的高[29]。

6 酰胺醇类

酰胺醇是一种广谱抗菌药物，其非氟化（如氯霉素）和氟化（如氟苯尼考）衍生物已用于兽医学。目前在动物中使用非氟化苯酚仅限于治疗伴侣动物和宠物，但氟化衍生物氟苯尼考已被批准用于治疗生产食品动物的细菌感染。耐药菌对氟苯尼考产生耐药的机制主要是通过特异/非特异的外排泵基因编码的外排泵系统使细菌获得耐药性[30]，其中以floR、fexA和fexB在各类耐药菌株中普遍流行。

高懿等[31]在111 株氟苯尼考耐药的猪源屎肠球菌中，检测出fexB、fexA、floR的携带率分别为58.56%、27.03%和17.12%；刘艳红等[32]对猪源和鸡源的氟苯尼考耐药大肠杆菌进行检测，发现其中61.2%含有floR基因；陈红梅等[33]对分离自福建、广东和江西的113 株禽源多杀性巴氏杆菌进行检测，发现floR的检出率为64.04%（72/113）；吴方达[34]对不同菌属的floR基因进行序列分析，发现不同细菌间的floR存在高度同源性。这些研究表明floR广泛存在于不同细菌间，且可在不同细菌间进行水平传播。

新疆农业大学动物医学学院的研究人员发现，耐药基因cfr、fexA和fexB的传播与插入序列IS21-558 和Tn558 转座酶基因有相关性[35-36]；张平等[37]在猪源肠球菌氟苯尼考耐药性调查中发现，fexA基因存在于Tn554 结构中。由此可见，养殖动物中酰胺醇类耐药基因以氟苯尼考耐药基因流传最广、影响最大，其在不同菌种间的普遍流行与移动元件的水平传播密切相关。

7 黏菌素

黏菌素是一种针对革兰氏阴性菌外膜脂多糖的多肽类抗菌药物，被广泛应用于兽医学，主要用于治疗或预防肠道感染。目前认为黏菌素的抗菌机制可能与编码革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）修饰酶的基因有关，操纵子pmrCAB编码3 种蛋白质，即磷酸化乙醇胺磷酸转移酶PmrC、反应调节剂PmrA（也称为BasR）和传感器激酶蛋白PmrB（也称为BasS）[38]。另外，有研究认为PhoPQ 双组分系统或其调节因子MgrB 的突变与黏菌素抗性有关。近年来国内学者还证明mcr-1的编码产物参与脂质A 的磷酸乙醇胺修饰，从而降低了黏菌素和细菌的静电作用，干扰了两者的结合效率，最终使细菌获得了耐药表型[39]。

Liu 等[39]从2013 年收集的上海某猪场的动物源菌株中首次报道了质粒介导的mcr-1。当前导致mcr-1流行的主要原因在于质粒介导的传播方式。该耐药机制导致黏菌素耐药菌株在近几年明显增多。易灵娴等[40]研究发现，mcr-1基因主要位于IncX4、Incl2、IncHI1、IncHl2、IncP、IncF 和IncF I Ⅱ型质粒上。李振斌等[41]选取2008—2015年采集的18 203 株大肠埃希菌和2009—2015 年采集的1 729 株沙门菌为研究对象，结果发现mcr-1总体检出率较低，但呈现增长趋势。该基因主要引起MIC=4 μg/mL 的低水平耐药且主要在大肠埃希菌中被检出。目前mcr-1阳性菌在国内的猪、禽养殖场中广泛流行，并且mcr-1基本都在肠杆菌科细菌中被检出。在黏菌素耐药基因中，mcr-1拥有多达7 种变体。除了国内最为流行的mcr-1，还有被陆续报道的mcr-2、mcr-3、mcr-4和mcr-5。

8 小结

当前国内耐药形式不容乐观，细菌对各类抗菌药均有不同程度的耐药，且耐药基因的种类繁多，在国内分布广泛，涉及的动物种类包含家禽、大型牲畜以及伴侣动物，在养殖场中主要以猪源和禽源菌株中的耐药基因检出率高。流行率和检测率较高的耐药基因多数能在质粒、整合子、转座子等移动元件上被检出，并以水平传播方式进行扩散。不仅如此，许多耐药性调查显示，在同一个质粒上检测出数种耐药基因。这些携带多种耐药基因的质粒是细菌产生多重耐药现象的重要原因。耐药菌株以及多重耐药菌株会给畜牧养殖造成巨大损失，并使得养殖动物成为耐药菌株不断增殖的“温床”。虽然耐药菌株可以在禽畜食品加工的过程中被杀灭，但是耐药基因依旧会残留在禽畜食品中，最终直接威胁到人类的健康安全。面对目前的耐药现状，我国政府部门已陆续出台了多项应对方案。通过实施遏制细菌耐药行动计划，提高养殖技术和做好生物安全防护，减少抗菌药使用，逐步走向“无抗养殖”模式，从根源上减少耐药基因的产生以及诱导产生的条件，从而改善国内的细菌性耐药现状。