羊传染性脓疱病毒OVIFNR 蛋白结构分析与B 细胞表位预测

成伟伟，陈伯祥，杨 明，赵子惠，常攀峰

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000）

羊传染性脓疱（俗称羊口疮）是由羊传染性脓疱病毒（ORFV）引起的一种以山羊和绵羊嘴唇和舌鼻等部位形成水泡、脓疱和结成厚痂的一种人兽共患传染病[1]。该病毒主要感染2～6 月龄的羔羊和部分免疫力下降的成年羊，被感染羔羊常因继发感染而死亡，被感染成年羊可因进食困难导致减产甚至死亡[2]。该病在规模化羊场流行广泛，给养羊业造成了严重经济损失。

OVIFNR 蛋白是ORFV 的抗性蛋白[3]，具有抗干扰素功能。OVIFNR 蛋白依靠其羧基末端的一段保守性基序，竞争性结合dsRNA 和病毒复制中间体，从而抑制干扰素（IFN）诱导的蛋白激酶PKR 的激活，达到阻止宿主细胞发挥抑制病毒蛋白翻译的作用[4-5]。目前，对OVIFNR 蛋白的结构和功能还不是很清楚。所以，本研究以从羊口疮确诊病例的嘴唇结痂扩增所得的OVIFNR基因序列为研究对象，应用生物信息学方法进行OVIFNR基因序列比较和ORFV 遗传进化分析，以及OVIFNR蛋白的理化特性、二级结构、三级结构和B 细胞表位预测分析，以期为OVIFNR 蛋白的功能研究和ORFV 检测方法的建立提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

甘肃省某羊场羊口疮确诊病羊的嘴唇结痂。ExTaqDNA聚合酶、dNTP、IPTG、X-gal、pMD18-T，均购自宝生物工程有限公司；DNA 提取试剂盒，购自QIAGEN 公司；DH5α 感受态细胞，购自天根生化有限公司；胶回收和质粒小提试剂盒，购自AXYGEN 公司。

1.2 结痂组织DNA 提取

取结痂组织100 mg 置于研钵中，加入液氮研成粉末；参照组织基因组DNA 提取试剂盒（QIAGEN）说明书的要求和步骤，提取总DNA；经紫外分光光度计检测浓度和纯度，-80 ℃保存。

1.3 引物设计、基因扩增

参照GenBank公布的ORFVOVIFNR（JN565695.1）基因序列，应用Primer 5.0软件设计引物。上引物：CCCAAGCTTATGGCCTGCGAGTGCGCGTCT（下划线部分为HindIII 酶切位点）；下引物：CGCGGATCCTTAGAAGCTGATGCCGCAGTTGTTGATG（下划线部分为BamHI 酶切位点）。引物均由上海桑尼有限公司合成。以1.2 提取的基因组DNA为模板，加入上下游引物进行PCR 反应。反应体系为：模板5 μL、premix ExTaq25 μL，上下引物各1 μL，ddH2O 加至50 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增结束后，取反应液5～10 μL，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。参照PCR 产物纯化试剂盒（AXYGEN）说明，将PCR 产物切胶回收纯化，与pMD18-T 载体连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞；涂布含氨苄青霉素、X-gal 和IPTG 的选择平板上培养12～16 h，然后进行蓝白斑筛选；挑取白色单菌落接种于LB 液体培养基，摇床培养6 h 后进行菌液PCR 鉴定。扩增条件与反应参数与上述PCR 反应相同。

1.4 序列测定和遗传进化分析

将上述PCR 鉴定为阳性的菌株，送上海桑尼测序公司测序；应用DNAstar 软件，对测序得到的基因序列和GenBank 公布的参考序列，分别进行核苷酸和氨基酸水平的同源性分析和遗传进化树构建[6-7]。

1.5 OVIFNR 蛋白理化特性和二、三级结构预测分析

运用在线工具ProtParam（网址为https://web.expasy.org/protparam/），分析OVIFNR 蛋白的理化特性[8]；利用DNAstar 软件的KyteDolittle 方法，预测OVIFNR 蛋白的亲水性和疏水性；利用在线软件TMHMM 和SingnalIP 分析工具（网址为http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/和http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），预测OVIFNR蛋白分子的跨膜区和信号肽[9]；利用DNAstar 软件，进行OVIFNR 蛋白的二级结构预测分析[10]。将OVIFNR 蛋白的氨基酸序列提交至在线工具Swiss-Model（网 址 为https://swissmodel.expasy.org/），构建OVIFNR 蛋白的三级结构模型[11-12]。

1.6 OVIFNR 蛋白的B 细胞表位预测

以OVIFNR 蛋白二级结构预测结果为参数，运用在线工具ABCpred（网址为http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/），综合分析预测OVIFNR 蛋白B 细胞表位[13-14]。

2 结果

2.1 序列测定及遗传进化分析

PCR 扩增得到大小约552 bp 的基因片段，与预期结果一致。序列测定结果显示，OVIFNR基因大小为552 bp，编码184 个氨基酸，GC 含量为60.51%。将该基因序列提交GenBank，获得序列号为KF916586，将所含该基因的毒株命名为orfvchGanSu。将GenBank 上公布的参考毒株（挑选了14 株，具体信息见表1）以及orfv-chGanSu 的OVIFNR基因进行核酸序列的多序列比对。结果（表2）显示：有两对毒株的OVIFNR基因序列同源性为100%，分别是Ena 和Matsumoto 株、Hoping 和Nantou 株。orfv-chGanSu 的OVIFNR基因序列与Hoping 和Nantou 株的同源性最高，为99.6%；orfv-chGanSu 与Hoping 和Nantou 株 在198 位和273 位上分别有2 个单核苷酸不同（在198 位 上orfv-chGanSu 是C，Hoping 和Nantou是T，在273 位 上orfv-chGanSu 是T，Hoping 和Nantou 是C），但都没有氨基酸序列的不同。orfvchGanSu 和D1701 株的同源性最低，为95.3%；orfv-chGanSu 和NZ2、OV-SA00、OV-IA82 株的同源性分别为96.0%、97.5%、96.7%。这些数据说明ORFV 各毒株的OVINR基因发生了突变（包括orfv-chGanSu）。

这14株参考毒株和orfv-chGanSu 株OVIFNR 蛋白的氨基酸序列比对结果见表2 左下部分。在所有105 个比对组合中，有7 个同源性为100%，其中Hoping、Nantou、ShanX 和orfvchGanSu 株的OVIFNR 蛋白氨基酸序列完全同源，Ena 和Matsumoto 完全同源。orfv-chGanSu与已公布的参考株OVIFNR 蛋白氨基酸序列的同源性为94.1%～100%，其中与D1701、NZ2、OV-IA82、OV-SA00 的同源性分别为94.1%、95.1%、95.1%、97.8%。通过遗传进化树可以发现，本次克隆的OVIFNR基因毒株与Hoping、ShanX、Nantou 株的关系最近，处于同一分支（图1）。这一点也为病毒存在的地理差异提供了证据（orfv-chGanSu、Hoping、ShanX、Nantou 都是国内毒株）。

表1 14 株ORFV 参考毒株信息

表2 ORFV 各毒株的OVIFNR 基因核酸和氨基酸同源性比对结果

图1 所扩增的OVIFNR 基因毒株与参考毒株遗传进化树

2.2 OVIFNR 蛋白的理化特性和二、三级结构预测分析

orfv-chGanSu 的OVIFNR蛋白理化特性如表3 所示。用KyteDolittle 法进行亲疏水性分析发现，OVIFNR 蛋白具有较强的亲水性，OVIFNR 蛋白亲水性区主要集中在12～29、30～46、47～64、65～85、120～140、156～165 等6 个区段（图2）；使用TMHMMH 和SOSUI服务器分析发现，OVIFNR 蛋白无跨膜区和信号肽。

OVIFNR 蛋白的二级结构预测结果如图3 所示：OVIFNR 蛋白的二级结构主要包括α 螺旋、β 折叠、β 转角和无规卷曲4 种类型，所占比重分别为68.64%、7.56%、15.13%和9.18%；OVIFNR蛋白的α 螺旋主要位于1～41、67～90、94～105、111～130、150～174 区段，β 折叠主要位于42～43、47～50、59～61、141～144、174～177、182～184 区段，β 转角分别位于43～48、51～54、56～59、61～63、91～93、105～106、131～137、138～141、146～147、177～181 区段，无规卷曲分别位于56～58、63～67、93～95、106～112、147～149、181～182 区 段。从 构建的OVIFNR 蛋白的三级结构（图4）可以看出，OVIFNR 蛋白结构比较简单，在OVIFNR 蛋白三级结构中α 螺旋占据较多的构象。

2.3 OVIFNR 蛋白B 细胞表位预测

利用ABCpred 预测的B 细胞抗原表位见表4。以预测的OVIFNR 蛋白二级结构的β 转角和无规卷曲为参数，综合筛选出OVIFNR 蛋白的优势B 细胞抗原表位位于41～48、51～54、56～67、91～95、105～112、131～141、146～149、177～181 区段。

表3 OVIFNR 蛋白的理化特性预测结果

图2 OVIFNR 蛋白的亲疏水性预测结果

图3 OVIFNR 蛋白二级结构预测结果

图4 OVIFNR 蛋白三级结构建模结果

表4 OVIFNR 蛋白B 细胞表位预测结果

3 讨论

将本研究中扩增所得的OVIFNR基因序列与14 株ORFV 的OVIFNR基因序列比较发现，没有同源性达到100%的毒株，与Hoping 和Nantou 株的同源性最高达到了99.6%。氨基酸序列比对发现，Hoping、Nantou、ShanX 和orfv-chGanSu 等 毒 株的OVIFNR 蛋白氨基酸序列完全同源。通过遗传进化树可以发现，本次克隆的OVIFNR基因毒株与Hoping、ShanX、Nantou 等毒株的关系最近，处于同一分支。这可能与地理分类有关，因为orfvchGanSu、Hoping、ShanX、Nantou 都是国内毒株。OVIFNR 蛋白理化特性预测表明，OVIFNR 蛋白半衰期长达30 h。如果将该蛋白作为免疫抗原，那么其在宿主体内能够稳定存在较长时间。OVIFNR 蛋白有较强的亲水性，无跨膜区，推测该蛋白可以实现高表达量的可溶性表达。预测的OVIFNR 蛋白二级结构含有丰富的α 螺旋结构和β 转角，推测出OVIFNR 蛋白比较稳定，含有较多的B 细胞抗原表位。三级结构的构建可以较直观地展现OVIFNR蛋白形态，从而为OVIFNR 蛋白功能的进一步研究提供可视化依据。

目前，基于生物信息学的B 细胞抗原表位预测方法发展迅速，已出现了多种方法，如基于多项物理、化学参数预测的Bcepred 方法，基于模拟肽的EpiSearch 在线方法和基于人工神经网络的ABCpred 方法，其中ABCpred 是应用比较广泛和具有较高准确率的预测方法[15-16]。本研究运用ABCpred 方法预测OVIFNR 蛋白B 细胞抗原表位，并以蛋白质二级结构预测结果为参数进行综合筛选，得到了具有较高可信度的优势B细胞抗原表位。