H1 亚型猪流感病毒微滴数字RT-PCR定量检测方法的建立

谭建锡，禹思宇，唐连飞，胡忆文，白 雪，侯义宏

（1.长沙海关技术中心，湖南长沙 410004；2.岳阳海关，湖南岳阳 414000；3.常德海关，湖南常德 415000）

猪流感（swine influenza，SI）是一种严重的呼吸道传染病，由猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起，具有急性、高度接触性、群发性等特点，临床主要表现为咳嗽、呼吸困难、发热，不同年龄、性别和品种的猪均能感染，是普遍存在于规模化养猪场中的群发性疾病[1]。猪体内混合有禽流感病毒和人流感病毒的受体，较易产生新型的重配病毒。SIV 在猪群中以H1 和H3 为主要流行亚型，因此如何快速有效检测H1亚型SIV 越来越受到关注。目前，流感病毒的快速检测主要利用基于分子技术的普通RT-PCR 和实时荧光RT-PCR 等方法[2]。荧光定量RT-PCR法具有较高特异性和灵敏度，应用较为广泛，但其定量测定需要用标准品建立标准曲线，因而操作耗时费力。

微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）作为一种新兴起的核酸绝对定量技术，可从溶液中直接获得样本拷贝数，而不需要依赖于标准品和标准曲线。其原理是通过极度稀释，在一定数目的微滴中分布1 个或0 个拷贝，进行PCR 单分子扩增后，读取样本荧光信号，再通过泊松（poisson）分布和统计学方法来计算核酸拷贝数。由于不依赖建立标准曲线，且对低浓度核酸样品也可进行高灵敏度的绝对定量，使得ddPCR 技术在核酸绝对定量领域有极大的应用前景[4]。已有文献[6]报道，将该技术应用于伪狂犬病病毒[5]和H7N9 流感病毒的定量研究，但未对ddPCR 退火温度进行优化，也未见将ddPCR 技术应用于H1 亚型SIV 绝对定量检测的相关报道。

本研究将ddPCR 技术应用于H1 亚型SIV 检测，并对其最佳退火温度、检出限以及检测准确度等方面进行研究，建立了H1 亚型SIV ddRT-PCR绝对定量检测方法，为我国H1 亚型SIV 的实时监控提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

H1、H3、H5、H7 亚型SIV，以及猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）均为灭活病毒，由长沙海关技术中心动物检疫实验室保存。

1.2 试剂和仪器

One-step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes、ddPCR droplet generation oil for Probes、Droplet Reader Oil：购自美国伯乐公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit：购自QIAGEN 公司；一步法qRTPCR 试剂（EvoScript RNA Probes Master）：购自瑞士罗氏公司；PX1 热封仪、微滴式数字PCR 仪：QX200伯乐；梯度PCR扩增仪：LabCycler 96，德国；荧光PCR 仪：LC480 罗氏。

1.3 引物设计

将GenBank 数据库中的H1 亚型SIV HA 基因序列进行生物学信息分析，选出高度保守且特异的区域（1 536～1 692 bp），利用Oligo 及Primer Premier 软件，设计并合成特异性引物和TaqMan荧光探针。试验中用到的引物及探针序列见表1，所有引物及探针均由Invitrogen 公司合成。

表1 H1 亚型SIV ddRT-PCR 引物和探针序列

1.4 RNA 提取

按照QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒说明书，提取H1、H3、H5 和H7 亚型流感病毒以及PRRSV、CSFV 等病毒的基因组RNA，并将提取好的RNA 保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.5 ddPCR 反应方法构建

反应体系（20 μL）：4×Supermix 5 μL，上、下游引物终浓度均为900 nmol/L，探针终浓度为250 nmol/L，以及300 nmol/L DTT 1 μL、RNA 模板2 μL，用ddH2O 补足至20 μL。

微滴生成：将20 μL 反应液和70 μL 微滴生成油，分别加入到微滴生成卡DG8 的中间和最后一排的各孔中，用专用胶垫覆盖后，放置于微滴生成仪上，自动生成微滴于第1 排；吸取40 μL 油滴加入96 孔板内。

封膜及扩增：将96 孔板放置于PX1 热封仪上，设置程序180 ℃ 10 s 进行封膜；之后，将封好膜的96 孔板放入梯度PCR 扩增仪上进行扩增。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃15 s，最佳退火温度1 min，40 个循环。

数据读取及分析：将96 孔板放入QX200 微滴式数字PCR 仪中读取信号，获得试验数据并分析。阴性对照中的模板用水代替。

1.6 退火温度条件优化

在PCR 仪上设置扩增温度梯度，退火梯度范围为55～61 ℃，温度间隔1 ℃，共7 个温度梯度。按照1.5 中的操作，对应设置PCR 扩增温度后进行反应，并进行数据分析；用RNA 核酸标准品进行试验，重复3 次，求平均值，确定最佳退火温度。

1.7 灵敏性及重复性试验

将H1 亚型SIV 核酸进行10 倍梯度稀释，并以此为模板，取2 μL 用已建立的ddRT-PCR 方法，测定最低检出限，并绘制线性标准曲线。反应体系和反应条件按照1.5 和1.6 筛选出的最佳条件设置。试验操作重复3 次，计算变异系数，进行重复性评估。

1.8 特异性试验

以H1、H3、H5 和H7 亚型SIV，以及PRRSV、CSFV 核酸为模板进行特异性检测。

1.9 临床应用

将从湖南省规模化猪场收集到的30 份猪鼻拭子样品提取核酸后，分别用本试验建立的ddRTPCR 方法和qRT-PCR 方法进行检测，对比检测结果的一致性。

2 结果与分析

2.1 ddRT-PCR 方法建立

根据已发表文献和试验指南，制备ddPCR 反应体系，对体系退火温度进行了优化，建立了H1亚型SIV ddRT-PCR 检测方法。结果（图1）显示，退火温度55～61 ℃范围内均有荧光信号被检出，阴阳性微滴有明显分界，且在57～58 ℃时出现最大扩增振幅；当温度为55 ℃时，阴阳性微滴中间略微存在弥散；当退火温度为56～61℃时，阴阳性微滴中间弥散较少，可能因温度太低引起的扩增特异性略有降低。综合考虑，选择58 ℃作为反应最佳退火温度。

图1 H1 亚型SIV ddPCR 退火温度优化结果

随着样本核酸浓度依次降低，由左到右（A03—H03），反应体系中阳性微滴数量（蓝色点）逐渐减少；相对应的，同体系中阴性反应的微滴数目（黑色点）则逐渐增加，颜色不断变深（图2）。直方图（图3）显示，阳性微滴峰的荧光强度普遍较高，而阴性微滴峰的荧光强度较低，且两者之间存在明显区分，无杂峰。以上结果说明，建立的H1 亚型SIV ddRT-PCR 方法有较高的可靠性。

图2 不同浓度下的H1 亚型SIV ddRT-PCR 散点图

图3 不同浓度下的H1 亚型SIV ddRT-PCR 直方图

2.2 标准曲线和最低检测限

分别用核酸稀释度和阳性拷贝数的对数值绘制标准曲线（图4），发现线性方程为y=-1.068 2x+5.855 6，线性关系R2值为0.994，最低检测限为4.7 copies/μL，表明此方法具有较好的线性关系。

图4 H1 亚型SIV ddRT-PCR 标准曲线

2.3 ddPCR 重复性分析

利用建立的ddPCR 方法，对同一核酸模板进行3 次重复试验，发现变异系数均〈5%，证明所建立的ddPCR 检测方法重复性良好，检测结果稳定、可靠（表2）。

表2 微滴式ddRT-PCR 重复性试验结果

2.4 ddPCR 特异性试验

以H1、H3、H5 和H7 亚型SIV 以及PRRSV和CSFV 的基因组RNA 为模板进行ddRT-PCR 扩增，发现各孔微滴的生成量比较均衡，能够满足试验成立条件。由图5 可知，仅H1 亚型SIV 检测孔出现阳性微滴，H3、H5、H7 亚型SIV，以及PRRSV、CSFV 和阴性对照孔中，均未检测到阳性微滴信号，即与其他病毒均无交叉反应，表明该方法检测H1 亚型SIV 核酸具有良好的特异性。

图5 H1 亚型SIV ddPCR 特异性试验结果

2.5 临床样品验证

将30 份猪鼻拭子样品提取RNA 后，分别用本试验建立的ddRT-PCR 方法以及qRT-PCR 方法进行检测，发现2 份样品均检测为阳性，其余28份样品均检测为阴性，表明两种方法检测结果一致，符合率为100%。

3 讨论

H1 亚型动物流感一直威胁着畜禽业的发展，同时也威胁着人类健康[7]。传统的荧光RT-PCR 方法被广泛用于流感病毒的定性检测，但其定量检测需要依赖外标对样品初始拷贝数定量后再进行测定，操作过程耗时费力[8]。随着新技术的发展，也有其他新方法被用于流感病毒的定量检测。王潇等[9]利用重组酶聚合酶扩增技术（RT-RPA）对H1 亚型动物流感进行检测，最低可检测到的病毒核酸浓度为0.96×10-2g/mL。刘文俊等[10]建立动物H1 亚型流感病毒（IV）的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条（RPA-LFD）检测方法，可检测到最低浓度为10 copies/μL 的重组质粒标准品。ddPCR 的最高检测拷贝数约为2×104copies/μL，初始浓度过高时，不符合泊松分布，无法实现对阳性微滴数的检测[5]。

数字微滴PCR 技术具有对反应条件要求较低、抑制剂对反应影响较小[11]、可检测到单个拷贝、不需要建立标准曲线等优点，使其在病毒定量检测中得到了广泛应用。本研究通过ddPCR 技术，建立了H1 亚型SIV 绝对定量方法，确定了最佳退火温度、核酸浓度范围及最低检出限，实现了直接得出样品中病毒核酸拷贝数的绝对定量和高灵敏度检测，为病毒的定量检测提供了一种新思路。ddRTPCR 也有其不足之处，目前微流控微滴芯片单次生成量较低，大量样品需多次操作，大多数仪器仅配置1～2 重荧光信号通道，因此多重荧光检测方面还需加强。随着未来技术的进步，高通量微流控微滴生成芯片的研制及高重荧光信号通道的出现，会大大提高ddPCR 技术的检测效率，将会推动其在更大领域的广泛应用。