人参灰霉病研究进展△

刘琨，李勇，王蓉，丁万隆

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

由灰葡萄孢BotrytiscinereaPers.引起的灰霉病是一种重要的全球性农业病害。灰葡萄孢寄主广泛，可侵染粮食作物、经济作物、蔬菜、果树、药用植物等586属1400余种植物[1]。灰葡萄孢潜伏期长且具有低温致病性，对贮藏期蔬菜、瓜果等威胁较大。

灰葡萄孢变异频率高、再侵染频繁、抗药性强，属于存在高抗药性风险的致病菌之一。灰葡萄孢以菌丝、分生孢子和菌核侵染寄主植物的茎、叶、花和果实等，并在侵染后期产生分生孢子或菌核[2]。

不同来源的灰葡萄孢无明显的寄主专化性，如灰葡萄孢B.cinerea、草莓葡萄孢B.fragariae、卡罗莱纳葡萄孢B.caroliniana、中华葡萄生葡萄孢B.sinoviticola和苹果葡萄孢B.mali均能引起草莓灰霉病[3]。农作物上的灰葡萄孢也可侵染人参引发病害，如：除人参灰霉菌外，番茄灰葡萄孢和草莓灰葡萄孢亦可侵染人参叶片，且致病力较强[4]。鉴于以上两点，建议在人参灰霉病综合防治中予以高度重视。

1 葡萄孢菌的分类

葡萄孢无性态属于半知菌亚门Deuteromycotina、丝孢纲Hyphomyeetes、丝孢目Myphomycetales、淡色孢科Moniliaceae，有性态属于子囊菌亚门Ascomycota、盘菌纲Discomycetes、柔膜菌目Helotiales、核盘菌科Selerotiniaeeae、葡萄孢盘菌属Botryotinia[5]。Botrytiscinerea是葡萄孢属真菌的一个复合种，也是本属最大的类群，常以无性态侵染植物并传播孢子。灰葡萄孢菌孢子梗细长不分枝或分枝群生，有隔膜，长317～940 μm，直径8.5～12.3 μm。灰葡萄孢菌菌丝透明，直径5～6 μm，分生孢子丛生于孢梗或小梗顶端，似葡萄串状，单个孢子倒卵形、球形或椭圆形，光滑，近无色，(8.4～15.8)μm×(6.3～12.6)μm。在PDA培养基上，菌落初呈淡白色，后转为灰色，同时伴有菌核生成[6]。

灰葡萄孢表型变异丰富，根据其分生孢子的产生、分布以及菌核有无，Paul[7]将其分为菌丝型、孢子型和菌核型。张艳杰等[8]通过形态观察和生长速率测定，将分离自不同葡萄种植区的143株灰葡萄孢菌划分为菌丝型(40.56%)和菌核型(59.44%)；菌丝型又分为6个亚型(M1～M6)，以M6亚型居多；菌核型分为5个亚型(S1～S4，S6)，以S3亚型居多。研究还发现，灰葡萄孢致病力与灰葡萄孢的形态型、寄主无明显相关性，但与菌株所在地域存在关联，通常相似环境分离的灰霉病菌致病力也相近。结合酶切片段以及环酰菌胺敏感性测定，Albertini等[9]、Fournier等[10]将灰葡萄孢B.cinerea分为2个亚种，即group I和group II；而Walker[11]通过对法国葡萄园灰霉菌多样性分析，将group I亚种重新命名为假灰葡萄孢B.pseudocinerea。

2 灰葡萄孢菌的致病机理

灰葡萄孢菌分生孢子首先附着于寄主表皮细胞，随后孢子萌发形成芽管和附着胞，帮助灰葡萄孢侵入[12]。灰霉菌可分泌大量的细胞壁降解酶，从寄主组织获取营养完成自身生活史[13]。灰葡萄孢菌侵染过程中产生纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶、活性氧物质、蛋白酶、脱落酸、乙烯、毒素等致病因子，用以扰乱、破坏寄主植物防御系统，杀死寄主细胞，成功完成侵染定殖。缺失上述致病因子合成相关基因会导致灰霉菌毒性减弱甚至完全丧失[14]。

死体营养型病菌侵染的最终结果是将寄主的营养物质分解转化为自身物质。灰葡萄孢菌寄主的共同特点是细胞壁中果胶含量高[15]。研究发现，灰葡萄孢菌至少含6种多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)基因，其在侵染时上述基因的表达情况与寄主、组织类型及环境因素等密切相关[15]。RNA-seq研究结果表明，灰葡萄孢菌能合成多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶、纤维素酶、半纤维素酶等水解酶，且侵染时灰葡萄孢水解酶的表达量与寄主果胶等多糖类物质含量密切相关[16]。

3 人参灰霉病的发生与危害

人参PanaxginsengC.A.Meyer为五加科人参属药用植物，为我国传统名贵中药材，主产于我国东北地区[17]。

人参灰霉病于1984年首次在中国浑北河口参场被发现，随后在韩国等地也有报道[18]。人参灰霉病通常6月下旬开始发生，7月中旬至8月下旬进入发病盛期。该病主要为害人参叶片、叶柄、花和果实，造成茎、叶萎缩枯死，严重时亦可为害茎及根部[19]。近年，灰霉病在东北人参产区危害逐年加重，通常病株率为15%～30%，严重地块超过50%，已成为影响人参产业持续健康发展的限制性因素之一[20]。

发病初期叶部出现水渍状、灰褐色斑点，多从叶尖或叶缘开始侵染而呈倒V形，后病斑迅速扩展，叶片正反面生出灰色霉层。发病后期病斑组织坏死，易破碎脱落，叶片穿孔[19]。茎部首先出现水浸状小点，逐渐扩展为浅褐色，长圆形或不规则形，严重时病部以上茎叶枯死，产生大量霉层；柱头或花瓣被侵染后，向果实或果柄扩展，受害果实不能成熟产籽[6]。

4 人参灰霉病的发病规律

4.1 灰霉菌生物学特性

灰葡萄孢菌丝在5～30 ℃均可生长，最适产孢温度25 ℃，孢子8～32 ℃均可萌发，孢子萌发和菌丝生长最适温度20～24 ℃。灰霉菌孢子萌发要求较高的相对湿度(RH≥90%)，湿度过低孢子无法萌发。灰葡萄孢菌丝生长和孢子萌发喜弱酸性环境，最适pH值分别为5.0和6.2，菌丝生长对光照不敏感[21]。人参灰霉菌孢子、菌丝和菌核致死条件分别为50、55、60 ℃处理10 min。

4.2 人参灰霉病病害循环

灰霉菌以菌丝体、分生孢子、菌核在病株残体或土壤中越冬。菌核抵抗不良环境条件的能力较强。翌年春天条件适宜时，灰霉菌菌核萌发产生新的菌丝体及分生孢子，后者经气流、雨水、农事操作、昆虫活动等途径在寄主间传播[22]。具备外渗物营养条件下，分生孢子萌发并通过伤口、自然孔口及幼嫩组织侵入寄主组织，新生成的分生孢子往复侵染，进一步导致病害发生和流行。灰霉病发生与环境温度、湿度关系密切，空气湿度高、浇水后逢雨天或地势低洼积水等，均有利人参灰霉病发生[23]。

4.3 影响病菌侵染的因素

灰葡萄孢是一种弱寄生真菌，通常无法侵染健康植物组织，只能在衰老植物组织中定殖。灰葡萄孢菌分生孢子浓度对侵染效果影响较大。高浓度分生孢子接种后多形成芽管的顶点型，能快速完成侵染；低浓度分生孢子接种后多形成附着胞和侵染垫，2～4 d完成侵染，及时施药可阻止侵染结构的形成，从而降低病害发生风险[24]。植物伤口可加快病菌侵入，即使空气中无自由水，分生孢子也可通过伤口完成侵染。

5 人参灰霉病的防治

灰霉菌基因型丰富，表现型多样，对环境适应性强。另外，灰霉菌繁殖快，变异频率高，对化学杀菌剂存在不同程度抗药性，导致人参灰霉病的防治难度较大。目前，用于人参灰霉病防治的技术手段主要有下面几种。

5.1 化学防治

化学防治是当前灰霉病防治中最为经济、有效，且使用最为普遍的防治方法。自20世纪70年代，相继开发出苯丙咪唑类、二甲酰亚胺类、N-苯基氨基甲酸酯类、苯基吡咯类、三唑类等化学杀菌剂用于人参灰霉病的防治。目前，人参病害登记农药有：苯醚甲环唑、丙环唑、赤霉酸、代森锰锌、多菌灵、多抗霉素、噁霉灵、哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌、醚菌酯、嘧菌环胺、嘧菌酯、噻虫·咯·霜灵、噻虫嗪、霜脲·锰锌、王铜、乙霉·多菌灵、异菌脲。2018年5月29日，在抚松召开了人参生产用药登记专家审定会，此次会议针对13种人参生产用农药——嘧菌酯、嘧霉胺、氟硅唑、烯酰吗啉、多抗霉素、氟啶胺、氟吗-唑菌脂、甲霜-霜霉威、精甲-恶霉灵、氢氧化铜、双炔酰菌胺、氨基寡糖素等通过初步评审。灰霉病防治的杀菌剂主要包括：异菌脲、嘧霉胺、腐霉利和福美双等。但是病菌对上述杀菌剂的抗(耐)药性也在逐渐产生，亟需寻求新的灰霉病防治方法，以减缓病菌抗药性的产生。

5.2 生物防治

生物防治是近年来新兴的植物病害防治方法，该方法环境友好、毒副作用小、无残留，是用于人参病害防治的理想选择。木霉是生物防治中应用最广的一类。其通过合成抗菌素、营养竞争、重寄生等途径达到抑菌效果[25]。Dik等[26]研究发现，哈茨木霉T39和出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans能显著降低灰霉病株死亡率，防效高于异菌脲。潘晓曦等[27]从人参根际土中筛选出7株枯草芽孢杆菌，其中6株对人参灰霉病有良好的抑制作用。上述菌株的挖掘为人参灰霉病生物防治奠定了良好基础。目前，受复杂环境因素的制约，微生物菌剂在使用中可能存在防效不稳定等问题，但是经过菌株改良及菌剂制备工艺的提升，相信上述问题都能得到解决。随着中药材人工栽培面积的不断扩大，药用植物病害问题愈发突出；加之国家对中药材病虫害防治过程中化学农药使用的严格限定和规范，生物防治将迎来巨大的发展空间。

5.3 其他途径

我国药用植物资源丰富，多种中草药中的药效物质或次生代谢产物对灰葡萄孢具有显著的抑菌效果。研究发现，木醋液对灰霉菌菌丝体及孢子萌发有很强的抑制作用[28]。潘晓曦等[29]研究发现，丁香、五味子、北豆根、细辛、白头翁、锦灯笼的乙醇提取物均对人参灰霉菌菌丝生长及孢子萌发有抑制作用；其中，丁香乙醇提取物的病害防效与多菌灵1000倍液相当[30]。此外，通过加强田间管理、合理灌溉、平衡施肥等手段，也可增强寄主抗病性，有效减缓人参灰霉病害的发生与危害。

6 结语

灰葡萄孢作为一个复杂的生物学群体，研究过程中应尽可能扩大取样范围及样本数量，深入探究病菌的形态型及基因型差异，以及致病性与地域、寄主来源、气候区等的关系。另外，还应结合抗药性实验，动态监测特定产区灰葡萄孢菌的抗药性变化情况，提早预防，防止高抗药性菌株引发严重的灰霉病流行。采用DNA重组技术、细胞质融合技术构建出耐不良环境或耐药性强的工程菌株[31]。灰葡萄菌的致病机理研究也在逐渐深入，为开发灰葡萄孢菌特有致病途径中的蛋白、酶抑制剂提供了理论基础[2]。

目前，植物病害防治主要依靠化学杀菌剂。但日益严重的环境污染、病菌抗药性及农药残留问题，迫使病害防治策略发生转变。积极研发新型高效、低毒化学农药，加快环境友好型微生物菌剂的研制、升级和示范推广，是确保人参灰霉病可防可控的关键[32]。此外，加强人参种植过程中的田间管理，对于人参病害防治也至关重要。