不同成熟度桑椹多酚绿原酸含量测定及抗氧化活性研究

韦丽文

柳州市中医医院，广西 柳州 545001

桑椹为桑科落叶乔木桑树MorusalbaL.的果实，为聚花果，由多数小瘦果实集合而成，呈长圆形，长1～2 cm，直径0.5～0.8 cm，黄棕色、红棕色或暗紫色，具有滋阴补血、生津润燥的功效，用于肝肾阴虚、心悸失眠、眩晕耳鸣、须发早白、内热消渴、津伤口渴、肠燥便秘[1]。桑椹被普遍认为以成熟的紫黑色者为佳，《说文》中记载，“黑葚之黑也”；《中华本草》中记载桑椹分为黄棕色、红棕色至暗紫色，但以肉厚、紫红色、糖性大者为佳。而现今对桑椹的研究也多是对紫黑色成熟果实进行的，其药用及营养价值得到普遍的认同，而对于未成熟的果实研究甚少。植物多酚是广泛存在的一类物质，具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、降血糖血脂等功效，被广泛应用于日常生活中[2-6]，桑椹中同样富含多酚成分，绿原酸为桑椹多酚的重要组成成分，经测定比较，绿原酸在桑椹成熟过程中含量变化较大，本实验以不同成熟度桑椹多酚为研究对象，探索其绿原酸含量与抗氧化活性在其成熟过程中的变化规律，分析其品质差别，扩宽桑椹资源的研究与利用。

1 材料

1.1 仪器

岛津UV1800紫外可见分光光度计；超声波清洗器(KQ5200B，昆山市超声仪器有限公司)；BP211D电子分析天平(德国赛多利斯公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；水浴锅(HH-S，江苏金坛市医疗仪器厂)；玻璃层析柱(10 mm×30 cm)；分液漏斗；移液枪(Eppendorf Research plus)。

1.2 试药

AB-8大孔树脂(天津市光复精细化工研究所)；盐酸(爱廉化试剂有限公司)；氢氧化钠(天津市博迪化工有限公司)；乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；石油醚(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；福林-酚试剂(上海荔达生物科技有限公司)；无水碳酸钠(分析纯，天津博迪化工股份有限公司)。

青、红、黑3种不同成熟度桑椹药材，采集于广西南宁市蚕业技术推广总站，样品经广西蚕业技术推广总站朱方容研究员鉴定为桑科桑属植物广东桑MorusatropurpureaRoxb.“桑特优二号” 的果穗。

2 桑椹多酚纯化

2.1 桑椹多酚粗提物制备

取过120目筛的青、红、黑桑椹粉末各2 g，精密称定，共3份，分别置于100 mL具塞三角瓶中，加入50%的乙醇溶液适量，超声提取20 min，离心取上清液，得到3种不同成熟度桑椹多酚粗提物。

2.2 桑椹多酚纯化

取预处理好的AB-8大孔树脂，精密称定，湿法上柱，用纯水冲洗至流出液透明。将3种不同成熟度的桑椹多酚粗提物分别控制流速为1.0 mL·min-1，进行动态吸附。将吸附后的AB-8大孔树脂用少量纯水冲洗，洗去可溶性杂质至流出液澄清，后用50%乙醇进行洗脱，洗脱速度为1.0 mL·min-1，合并洗脱液，得桑椹3种不同成熟度多酚纯化物。

3 不同成熟度桑椹多酚绿原酸含量测定

3.1 药材

按照2项下制备的桑椹多酚纯化物。

3.2 试剂

绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110753-201205，供含量测定用)；乙腈(色谱纯，Fisher Scientific)；甲醇(色谱纯，Fisher Scientific)；冰醋酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；水为超纯水(美国Millipore密理博明澈TMD超纯水系统)。

3.3 仪器

Agilent1200高效液相色谱仪，含在线真空脱气机(G1322A)、高压四元泵(G1311A)、标准自动进样器(G1329A)、智能化柱温箱(G1316A)、二极管阵列检测器(G1315D)、Agilent Chemistation色谱工作站；高速冷冻离心机(TGL-20M，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司)；超声波清洗仪(KQ5200B，昆山市超声仪器有限公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多AE100电子分析天平)；美国Millipore密理博明澈TMD超纯水系统；移液枪(Eppendorf Research plus)；水浴锅(HH-S江苏金坛市医疗仪器厂)；紫外可见分光光度计(日本岛津)。

3.4 方法与结果

3.4.1 色谱条件 安捷伦Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%醋酸系统；流速为0.8 mL·min-1；检测波长为327 nm；柱温为25 ℃；进样量为10 μL。洗脱程序见表1。

表1 绿原酸含量测定洗脱条件

3.4.2 对照品溶液配制 取绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶液制成质量浓度为0.11 mg·mL-1的绿原酸溶液，即得。

3.4.3 供试品溶液配制 青、红、黑3种不同成熟度的桑椹多酚纯化物适量，精密称定，加50%甲醇溶液分别制成相应浓度的供试品溶液，离心，取上清液备用，得供试品溶液。

3.4.4 方法学考察

3.4.4.1 标准曲线绘制 取3.4.2的对照品溶液，分别稀释为0、5、10、25、50、100倍，按3.4.1项下色谱条件进样。以绿原酸峰面积为纵坐标，绿原酸浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为：Y=46 437X-15.21，r=0.999 9；表明绿原酸质量浓度在0.001 1～0.11 mg·mL-1线性关系良好

3.4.4.2 精密度试验 取质量浓度为0.022 mg·mL-1的绿原酸对照品溶液，按按3.4.1项下色谱条件连续进样6针，峰面积分别为913、912.1、910.1、904.3、902.9、903.5，RSD为0.25%，符合定量分析要求。

3.4.4.3 重复性试验 按3.4.3项下供试品溶液制备方法，取青桑椹多酚纯化物制备成1.0 mg·mL-1的溶液，平行制备6份，按3.4.1项下色谱条件进样，计算绿原酸含量，RSD=1.84%，符合定量分析要求。

3.4.4.4 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液(青桑椹多酚溶液1.0 mg·mL-1)，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，按3.4.1项下色谱条件测定，RSD=1.26%，说明样品在24 h内稳定。

3.4.4.5 加样回收率试验 取已知含量的青桑椹多酚纯化物适量，精密称定，配制成2.0 mg·mL-1的青桑椹多酚溶液，取0.5 mL该溶液，置于2.0 mL容量瓶，加入质量浓度为0.05 mg·mL-1的绿原酸对照品溶液0.5 mL，定容，平行6份，按3.4.1项下色谱条件进样，计算绿原酸含量，测得平均回收率为97.7%，RSD为2.3%。结果见表2。

表2 绿原酸含量测定回收率考察结果(n=6)

3.4.4.6样品测定 按3.4.3项下所述制备供试品溶液，青桑椹多酚溶液1.0 mg·mL-1，红桑椹多酚溶液2.0 mg·mL-1，黑桑椹多酚溶液5.0 mg·mL-1，按3.4.1项下的色谱条件进样，测绿原酸峰面积，根据回归方程计算含量，绿原酸对照品及样品HPLC图见图1～4。

图1 绿原酸对照品HPLC图

图2 青桑椹多酚绿原酸HPLC图

图3 红桑椹多酚纯化物绿原酸HPLC图

图4 黑桑椹多酚纯化物HPLC图

3.4.4.7 样品测定结果 由表3测定结果可知，青桑椹多酚中绿原酸质量分数为46.8 mg·g-1，红桑椹多酚质量分数为29.5 mg·g-1，黑桑椹多酚质量分数为1.7 mg·g-1，由此可知，绿原酸含量排序为青桑椹多酚纯化物>红桑椹多酚纯化物>黑桑椹多酚纯化物。

表3 不同成熟度桑椹多酚中绿原酸的含量测定数据

4 不同成熟度桑椹多酚纯化物抗氧化活性

4.1 材料

4.1.1 材料 按照2项下制得的青、红、黑桑椹多酚纯化物。

4.1.2 仪器 分析天平BP211D电子分析天平(德国赛多利斯公司)；移液枪(Eppendorf Research plus)；水浴锅(HH-S，江苏金坛市医疗仪器厂)；紫外可见分光光度计(日本岛津)。

4.1.3 试剂 总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒、VC对照品(南京建成生物工程研究院)；冰醋酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

4.2 总抗氧化能力(T-AOC)测试

4.2.1 原理 抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。

4.2.2 总抗氧化实验与结果 取2项下制得的青、红、黑桑椹多酚纯化物适量，精密称定，分别加2.0 mL纯水进行溶解，将3种成熟度的桑椹多酚纯化物配制成质量浓度为0.57 mg·mL-1的桑椹多酚溶液，将配制好的桑椹多酚纯化物分别按1∶1、1∶5、1∶15、1∶25的比例稀释，稀释倍数分别为2、6、16、26，按照说明书的步骤方法做总抗氧化能力测试，每种稀释浓度平行3份，并将Vc对照品也配制成0.57 mg·mL-1，作为阳性对照，计算总抗氧化能力。运用SPSS21.0，考察桑椹多酚稀释倍数及成熟度双因素对其总抗氧化能力的影响，将稀释倍数2、6、16、26与成熟度青、黑、红、Vc 4个水平进行双因素考察，结果见表4～8，由表6可以看出不同稀释倍数、成熟度以及稀释倍数与成熟度的交互作用对桑椹多酚总抗氧化能力影响差异有统计学意义；由表7可以看出3种成熟度的桑椹多酚稀释倍数越小，即桑椹多酚浓度越大，总抗氧化能力越强；而由表8可以看出不同成熟度总抗氧化能力大小为VC>青桑椹多酚>黑桑椹多酚>红桑椹多酚。

表4 3种成熟度桑椹多酚纯化物抗氧化能力测试结果

注：表中数值越大表明总抗氧化能力越强。

表5 3种成熟度不同稀释倍数桑椹多酚纯化物总抗氧化能力的描述统计

注：因变量为总抗氧化能力。

表6 3种成熟度不同稀释倍数桑椹多酚纯化物总抗氧化能力的主体间效应检验

表7 不同稀释倍数桑椹多酚纯化物总抗氧化能力的对比统计

注：数值越大，表示总抗氧化能力越强。

表8 3种成熟度桑椹多酚纯化物总抗氧化能力对比统计

注：数值越大，表示总抗氧化能力越强。

5 讨论

青、红、黑3种成熟度桑椹多酚中均含有绿原酸，绿原酸质量分数分别为46.8、29.5、1.7 mg·g-1，由此可见，绿原酸含量在桑椹成熟过程中变化较大，桑椹成熟度越高，其绿原酸含量越低。

通过实验对比发现，青、红、黑3种成熟度桑椹多酚都有抗氧化活性。将同一成熟度的桑椹多酚抗氧化能力进行比较，总抗氧化能力随着桑椹多酚浓度的增大而增强；而将不同成熟度桑椹多酚抗氧化能力进行比较发现，在一定浓度范围内，3种成熟度的桑椹多酚的总抗氧化能力次序为青桑椹多酚>黑桑椹多酚>红桑椹多酚，与绿原酸含量的变化并没有直接联系，这与桑椹多酚在成熟过程中成分变化有关，桑椹多酚中除了绿原酸外，还有如芦丁、花青素等多种成分，同样也具有抗氧化活性[7-8]，因此，桑椹多酚的抗氧化活性是多种成分共同作用的结果，而其中哪一种成分的抗氧化活性最强，且随着桑椹成熟过程中，成分含量有着怎样的变化还有待进一步研究。

通过实验发现，除了大家所熟悉的黑桑椹中的多酚成分具有抗氧化活性外，青、红桑椹多酚纯化物的抗氧化活性不容小觑，这就意味着可以扩大桑椹资源的利用，人们食用的都是成熟的黑桑椹，没有对未成熟的桑椹进行开发利用，那么，对于食品工业的保鲜剂、生态环境中的去污剂在医药行业中的应用，都可以对未成熟的桑椹多酚进行开发利用。