荚蒾属植物DNA条形码鉴定△

吴田泽，陈露，肖煜强，邹问汀，胡心怡，李宇阳，刘霞*，黄升

1.武汉理工大学 化学化工与生命科学学院，湖北 武汉 430070；2.湖北民族大学 林学园艺学院，湖北 恩施 445000；3.恩施冬升植物开发有限责任公司，湖北 恩施 445000

荚蒾属ViburnumLinn.植物属五福花科Adoxaceae灌木或小乔木，分布于我国各省，尤以西南部地区种类最多，具有相当长久的应用观赏历史。同时，荚蒾属植物一直被作为民间药用植物，具有悠久的药用历史。荚蒾属植物始载于《新修本草》，具有清热解毒、祛风除湿、健脾消食、抗衰老、强身、驱虫等作用，临床可用于治疗小儿疳积、小儿发育不良、妇科疾病等[1-2]。目前，荚蒾属很多物种未得到很好的开发和利用，其中活性成分的研究仍未完全明确。因此，建立一种快速、有效的鉴别方法将为其开发利用及活性成分的研究奠定重要基础。

中药材的传统鉴别方法主要有基原鉴定、形态鉴定、显微鉴定和理化鉴定等，均具有不同程度的局限性。在中药材鉴定中，DNA条形码鉴定相比于传统中药鉴定方法有着革命性的进步[3-4]。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认标准的、易扩增且相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术[5]，该DNA片段具有种间的多样性及特异性，不受生物个体发育状况及其形态特征所限制，可克服对经验鉴定的过度依赖，实现自动化和标准化[6-7]。中药材DNA条形码分子鉴定是以ITS2为主体条形码序列鉴定中药材的方法体系，其中植物类中药材选用ITS2为主体序列、psbA-trnH为辅助序列，主要适用于中药材(包括药材、药材粉末以及部分药材饮片)及基原物种的鉴定[1，4]，并且已在野菊[8]、霍山石斛[9]、羌活[10]、冬虫夏草[11]、枸杞子[12]等中药材上得到验证。

本研究旨在通过DNA条形码分子鉴定法对荚蒾属类不同种类药用植物进行鉴别研究，包括珊瑚树、鸡树条、水红木、烟管荚蒾等13种荚蒾属药用植物，建立该属药用植物鉴定的新方法，为其质量控制、合理开发利用提供科学依据。

1 材料

1.1 DNA条形码鉴定材料

本研究通过野外考察等方式收集了荚蒾属植物13种，共32份样品，其中水红木Viburnumcylindricum5份，川西荚蒾V.davidii2份，细梗红荚蒾V.erubesens1份，珍珠荚蒾V.foetidumvar.ceanothoides1份，直角荚蒾V.foetidumvar.rectangulatum1份，珊瑚树荚蒾V.odoratissimum2份，少花荚蒾V.oliganthum1份，鸡树条V.opulusvar.calvescens3份，蝴蝶戏珠花V.plicatumvar.tomentosum2份，球核荚蒾V.propinquum5份，皱叶荚蒾V.rhytidophyllum5份，台东荚蒾V.taitoense2份，烟管荚蒾V.utile2份，分别来自湖北、四川、云南等地。所有样品经中国科学院武汉植物园标本馆原馆长赵子恩研究员鉴定，样品保存在武汉理工大学化学化工与生命科学学院中药资源与分子鉴定实验室。详细样品信息见表1。另从GenBank数据库中下载上述13个物种ITS2序列共14条。见表2。

表1 采集的荚蒾属植物样品信息

表2 GenBank下载序列信息表

1.2 仪器与试剂

本实验所用仪器见表3，所用试剂见表4。

表3 DNA条形码研究所用仪器

表4 DNA条形码研究所用试剂

2 方法

2.1 样品处理及DNA提取

称取样品的干燥叶或果实20～30 mg，用高通量组织研磨器研磨120 s(50 Hz)，核分离液(2% PVP，20 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1pH 8.0 Tris-HCl和0.7 mol·L-1NaCl)800 μL 抽提3次，56 ℃水浴过夜，然后用三氯甲烷-异戊醇(24∶1)800 μL抽提2次。利用植物基因组DNA提取试剂盒法(Tiangen Biotech Co.，China)提取总DNA[13]，提取完成后，用50 μL ddH2O洗脱，4 ℃保存备用。

2.2 ITS2序列扩增和测序

以样品DNA为模板，对ITS2序列进行扩增，引物、PCR反应条件及扩增程序均参考陈士林研究员课题组的研究[13-14]，详细条件见表5。采用25 μL PCR反应体系：Premi X TaqTM酶12.5 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，灭菌双蒸水8.5 μL，DNA模板2 μL。对扩增后产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在120 V电泳电压下电泳20 min，利用DNA Marker判断扩增产物的片段大小以及含量大小，并送至生工生物工程(上海)有限公司武汉分公司进行双向测序。

表5 扩增引物及反应条件

2.3 数据处理

测序所得DNA序列峰图，运用CodonCode Aligner V 6.0.2(Codon Code Co.，USA)软件进行质量分析和拼接校对，采用基于隐马尔科夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S rRNA和28S rRNA区段获得完整的ITS2序列[15]。将所有DNA序列使用MEGA5.1处理软件进行保守位点、变异位点等信息的分析比对，同时基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型计算遗传距离并分析，采用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统聚类树[16]，利用bootstrap(1000次重复)检验各分支的支持率。

3 结果与分析

3.1 种内变异分析

本研究中13种荚蒾属药用植物ITS2序列特征见表6。水红木共6条序列，长度224～254 bp，48 bp处存在T-C变异，59 bp处存在A-T变异，239 bp处存在G-A变异，246 bp处存在T-C变异；平均GC质量分数为65.1%。川西荚蒾共3条序列，长度为223～253 bp，不存在种内变异位点；平均GC质量分数为65.8%。细梗红荚蒾共2条序列，长度为219～225 bp，不存在种内变异位点；平均GC质量分数为61.0%。珍珠荚蒾共2条序列，长度为230～254 bp，不存在种内变异位点；平均GC质量分数为68.0%。直角荚蒾共2条序列，长度为224～230 bp，75 bp处存在C-G变异，173 bp处存在C-T变异；平均GC质量分数为67.6%。珊瑚树荚蒾共3条序列，长度为219～225 bp，不存在种内变异位点；平均GC质量分数为61.0%。少花荚蒾共2条序列，长度为219～225 bp，不存在种内变异位点；平均GC质量分数为61.3%。鸡树条共4条序列，长度为220～251 bp，在85 bp处存在G-A变异；平均GC质量分数为67.2%。蝴蝶戏珠花共3条序列，长度为219～249 bp，75 bp处存在C-T变异，76 bp处存在A-G变异，106 bp处存在C-T变异；平均GC质量分数为59.9%。球核荚蒾共6条序列，长度为208～229 bp，152 bp处存在G-A变异，209 bp处存在G-A变异；平均GC质量分数为67.3%。皱叶荚蒾共6条序列，长度为219～249 bp，在71 bp处存在T-C变异；平均GC质量分数为66.5%。台东荚蒾共3条序列，长度为208～249 bp，141 bp处存在C-T变异，167 bp处存在A-G变异，237 bp处存在C-T变异；平均GC质量分数为61.6%。烟管荚蒾共3条序列，长度为219～249 bp，在70 bp处存在T-C变异；平均GC质量分数为67.2%。

表6 样品ITS2序列特征表

3.2 K2P遗传距离分析

利用K2P模型计算遗传距离，ITS2序列种内、种间平均遗传距离见表7。结果显示，水红木种内最大遗传距离为0.014 8，小于种间最小遗传距离0.029 8；川西荚蒾种内遗传距离为0，小于种间最小遗传距离0.019 8；细梗红荚蒾种内遗传距离为0，小于种间最小遗传距离0.009 8；珍珠荚蒾种内遗传距离为0，小于种间最小遗传距离0.014 8；直角荚蒾种内最大遗传距离为0.009 8，小于种间最小遗传距离0.014 8；珊瑚树荚蒾种内遗传距离为0，小于种间最小遗传距离0.019 7；少花荚蒾种内遗传距离为0，小于种间最小遗传距离0.009 8；鸡树条种内最大遗传距离为0.004 9，小于种间最小遗传距离0.030 2；蝴蝶戏珠花种内最大遗传距离为0.019 8，小于种间最小遗传距离0.035 4；球核荚蒾种内最大遗传距离为0.009 8，小于种间最小遗传距离0.019 8；皱叶荚蒾种内最大遗传距离0.004 9，小于种间最小遗传距离0.014 7；台东荚蒾种内最大遗传距离为0.014 7，小于种间最小遗传距离0.014 9；烟管荚蒾种内最大遗传距离为0.004 9，小于种间最小遗传距离0.014 7。13种荚蒾属植物样本种间遗传距离均大于种内遗传距离，表明ITS2序列作为条形码基本可将荚蒾属药用植物从种水平上分开。各物种间遗传距离为0.009 8～0.119 1，其中少花荚蒾与细梗红荚蒾种间遗传距离最近，台东荚蒾和鸡树条种间遗传距离最远。

表7 13种荚蒾属药用植物种内和种间遗传距离

3.3 系统进化树(NJ树)分析

基于ITS2序列对13种荚蒾属药用植物构建NJ系统聚类树，利用bootstrap 1000次检验各分支置信度，各分支置信度均大于50%，见图1。图中水红木以89%置信度聚为一支；鸡树条以99%置信度聚为一支；珍珠荚蒾以85%置信度聚为一支；直角荚蒾以55%置信度聚为一支；川西荚蒾以83%置信度聚为一支；球核荚蒾以94%置信度聚为一支；烟管荚蒾以90%置信度聚为一支；皱叶荚蒾以75%置信度聚为一支；蝴蝶戏珠花以95%置信度聚为一支；少花荚蒾以66%置信度聚为一支；细梗红荚蒾以65%置信度聚为一支；珊瑚树荚蒾以90%置信度聚为一支；台东荚蒾以92%置信度聚为一支。每种荚蒾属植物均呈现良好的单系性，可从NJ树得到各个物种之间的进化和亲缘关系。由此可见，利用ITS2序列作为条形码可将荚蒾属植物分开。

4 讨论

荚蒾属植物多为灌木或小乔木，花序为聚伞花序组成的复伞形花序或圆锥花序，小花繁多，白色，果实成熟时为紫红色，具有极高观赏价值。该属植物在全世界约230多种，亚洲、南美洲种类较多。我国有74种，其中具有药用价值的种类已达43种，其中以枝入药的有11种，以根茎入药的有11种，以根、茎、叶入药的有4种，以根、果入药的有8种，以根、茎、叶及花果入药的有9种[16]。荚蒾属植物药用活性成分包括绿原酸、黄酮类、熊果酸、酚类、乙酰胆碱酶、β-谷甾醇等，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌抗病毒、降低血脂和血糖等功能[2，17-20]。

4.1 ITS2序列鉴定方法

荚蒾属植物物种类型多样，由于其植物形态的相似性、遗传关系的复杂性，因此鉴定荚蒾属植物是一个难题。刘震等[21]对忍冬科药用植物DNA条形码通用序列的筛选实验中，利用ITS2序列成功完全区分开6个荚蒾属近缘种，为本实验荚蒾属物种鉴别提供了一定指导依据。

在本实验中，13种荚蒾属植物提取到高质量ITS2序列的成功率为100%，ITS2序列的种内变异均较小，具有良好的稳定性。13种荚蒾属植物ITS2序列种内最大遗传距离均小于种间最小遗传距离；将所有样品的ITS2序列基于以邻接法、最大简约法、最大似然法估计构建NJ树的结果表明，各种荚蒾属植物均独自聚为一支，表现出良好的单系性。证实ITS2条形码序列能准确鉴别荚蒾属药用植物。综上所述，ITS2序列可用于荚蒾属药用植物的鉴定，是基于分子条形码技术鉴定的理想序列。

注：Bootstrap 1000次重复，支上数值仅显示自展支持率≥50%。图1 样品ITS2序列构建的13种荚蒾属植物的NJ系统聚类树

4.2 研究展望

本实验主要研究了我国分布在四川、湖北等地的川西荚蒾、皱叶荚蒾、珊瑚树荚蒾等品种，还有许多荚蒾属其他品种没有进行全面采集研究，需要进一步扩大样品量来验证鉴定体系的精密性与有效性。

本研究通过ITS2序列鉴定，可以确切鉴定物种是否为荚蒾属植物，并且可以初步确定被测样品物种，为后续的荚蒾属鉴定体系鉴定发展打下了坚实的基础。在后续的研究中，可以在本研究采用的ITS2序列的基础上，使用psbA-trnH、rbcL、matK等其他DNA条形码序列进行延伸研究和辅助验证。从而构建更加准确、快速的荚蒾属植物DNA条形码鉴定体系，并辅以传统的鉴定方法，为荚蒾属植物鉴定提供有力的方法。

5 总结

本研究通过荚蒾属植物样品DNA提取、ITS2序列和psbA-trnH序列扩增、DNA条形码测序以及系统进化树分析，确定了荚蒾属植物种间鉴定体系，不仅可以初步进行荚蒾属植物鉴定，为日后更加准确、快速地鉴定荚蒾属植物打下坚实的基础，从而更好地进行荚蒾属植物的开发与利用研究。