番茄花粉败育型雄性不育研究进展

暴会会，王少坤，尹竹君，马瑞红，谢俊俊，张 杰，杨正安*

(1.云南农业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650201；2.玉溪市澄江县经济作物工作站，云南 玉溪 652599)

番茄(LycopersiconesculentumMill.)属茄科(Solanoideae)番茄属(Lycopersicon)自花授粉的一种蔬菜作物。2018年10月发表于《Nature》的文章，李停栋[1]和Agustin Zsogon等[2]利用基因编辑技术CRISPR-Cas9，靶向番茄产量、生产力、营养品质相关的基因成功驯化野生番茄，同时后代保持亲本的优良特性，加速了育种进程。可见，番茄改良育种及相关研究在中国乃至世界得到持续关注。但目前番茄杂交制种仍以人工去雄为主，费时费力、制种成本高且杂交种纯度低。一直以来花粉不育型和雄蕊退化型保持较困难，功能不育型受环境影响较大，不易达到100%不育度，致使这些不育类型极少在生产上应用[3]。目前，随着科学家对拟南芥和水稻的花药和花粉发育的分子调控机制研究的不断深入[4]，通过人工创制番茄花粉败育型雄性不育突变体已成为可能。尽管花药发育机理已在拟南芥和水稻中开展了大量的研究工作，但有关番茄花药和花粉发育调控相关机理的深入研究却报道较少。因此，要想获得具有应用价值的番茄不育材料，必须加强对番茄雄性不育调控机制的研究。

1 番茄雄性不育概述

植物雄性不育在植物界存在普遍，雄性不育的植株雄蕊发育不正常。利用雄性不育可以免去人工去雄这一步骤，简化制种程序，降低种子成本，提高种子纯度。番茄雄性不育分为以下4种类型：部位不育(L型不育)、功能不育(J型不育)、雄蕊退化型、花粉败育型。其中，花粉败育型的主要表现为空瘪花粉、不能形成正常的四分体。番茄花粉败育主要发生在减数第二次有丝分裂后期至四分体形成之际(约42%)和小孢子发育早期至大液泡形成之前(约52%)。败育的直接原因有：部分绒毡层细胞的提早溶解、不同时溶解或溶解不彻底造成减数分裂后小孢子营养不足，从而导致发育异常。国内外学者从细胞学、生理生化、分子机制等多方面对番茄进行了深入研究。番茄雄性不育受多种因素影响，从而可以通过多种途径创造雄性不育突变体。例如，改变内源激素平衡[5-6]、调节物质能量代谢[7]、化学诱导[8]、分子标记技术[9]等。在遗传育种方面，基因工程技术弥补了常规杂交育种的不足，可以根据所需条件，有目的且有效地筛选目标性状选育新品种，创制新的植物种质资源。利用基因工程技术可以提高番茄产量、改良品质、增强抗性[10]。在番茄应用上可以利用基因工程技术创制雄性不育突变体，对花粉败育相关基因进行精确编辑，加速我国番茄雄性不育发展进程。

2 影响番茄花粉败育的因素

2.1 环境

番茄雄性不育的表达易受环境调控，育性转换有时量变，有时质变，这种转换方式为人工生理调控育性创造了条件。育性基因型品种即使正常条件下也不是可育的，如遇到高温干旱、冷害、缺素、光照不足等均可能引起生理性不育。光周期对小孢子不同时期也有不同影响[11]。Peet等[12]认为，高温可使花粉减少，并且随着高温时间的延长，花粉减少的数量也随之增加，不育性增加，尤其是夜温对不育影响更大。Santokh等[13]认为，低温可使sl-2育性恢复。总之，温度对雄性不育的影响主要由于花粉等发育相关代谢化合物的改变而引起的。Fellner等[14]发现，番茄花粉败育突变体受光周期调节，长日照条件(16 h/8 h)表现雄蕊皱缩，无法产生可见花粉；短日照条件(8 h/16 h)可产生正常花粉。

2.2 激素

在前人对无雄蕊番茄的研究中，有研究表明生长素的积累与花粉败育有关[15-16]。在雄性不育突变体番茄sl-2的花和叶片中，内源GA含量低于正常可育株[6]。使用CCC处理可抑制番茄离体培养花芽雄蕊正常发育[17]。高含量的IAA和低含量的GA是引起sl-2雄性不育的因素之一，可能与生长素诱导乙烯产生有关[18]。绒毡层延迟退化或者提前解体可导致花粉败育，IAA在调节养分竞争方面起了重要作用。因此，在花药中尤其是在绒毡层中，IAA的积累或者缺少与绒毡层解体时间的相关性需要进一步研究[6]。另外，番茄不育类型ABA浓度较高，在雄蕊中表现的尤其明显。其中，ABA含量受温度影响，低温条件ABA含量相对降低，与低温试sl-2育性恢复相关[13]。

总之，通过环境的改变可以导致番茄雄性不育，但这种不育往往是不确定的，难以应用于商业化生产。只有进一步研究是什么导致番茄的雄性不育，对其进行精确的分子机制解析，才能更好地将番茄雄性不育应用于生产之中。

3 番茄花粉败育型雄性不育的分子机制

3.1 花药绒毡层发育相关基因研究进展

高等植物花发育是植物发育的中心环节，是植物个体由营养生长向生殖生长转变的结果和植物繁殖的基础[19]。花粉壁作为植物细胞的一种防御结构，在花粉发育和受精过程中起着重要的作用。花粉壁的发育经历初生外壁形成、外壁形成、内壁形成，与花药中一个重要结构——绒毡层发育密切相关[20]。花药壁细胞中最内的一层为绒毡层细胞，与小孢子母细胞及花药发育后期的小孢子直接相互作用，在花粉发育过程中至关重要。同时，绒毡层还能分泌一些物质，参与植物授粉过程中花粉和柱头间的识别[21]。绒毡层发育任一过程受阻都会导致雄性不育。花药绒毡层细胞需要经过一个细胞程序性死亡的降解过程，为小孢子的发育提供营养和物质保证，番茄的绒毡层细胞属于变形绒毡层类型，在四分体时期溶解，形成周原质团，提前或延迟降解都会导致番茄雄性不育[22]。

植物花粉外壁外层由孢粉素组成，孢粉素在花药发育四分体时期组成，拟南芥中已报道了8个孢粉素合成基因[23-29]。在孢粉素前体合成过程中，线粒体释放出的乙酰辅酶A作为质粒脂肪酸合成(FAS)的底物。C12、C16、C18脂肪酸合成后，用Acyl-CoA合成酶5(ACOS5)修饰后转移至内质网(ER)，经过CYP703A和CYP704B的羟基化后，再用ACOS5对产物进行辅酶A-酯化。最后通过下游的MS2和LAP5/6将产物转化为孢粉素前体[30-33]。透射电子显微镜下的免疫化学定位显示ACOS5、PKSA/B、TKPR1/2定位于绒毡层细胞[34]。Xiong等研究认为CYP703A2-GFP定位于绒毡层和花药室中[35]。另外，杨仲南等利用GFP融合基因转基因植株，发现了孢粉素合成基因在绒毡层细胞表达，结果表明，所有孢粉质生物合成蛋白质在绒毡层中特异性表达并分泌到花药室中[36]。

绒毡层发育特征性决定基因首先在拟南芥中被分离和报道，SPOROCYTELESS(SPL)/NOZZLE(NZZ)基因的突变，导致绒毡层、花粉囊、孢子母细胞原基发育受阻，不能形成花粉囊[37]。花药细胞分化早期调控绒毡层发育的基因有AG、SPL/NZZ、TPD1、EMS/EXS、MPK3/MPK6、BAM1/BAM2、ER/ERL1/ERL2等[38-40]。TDF1(TAPETAL DEVELOPMENT AND FUNCTION 1)、AMS(ABORTED MICROSPORES)、MYB103、MS1(MALE STERILITY1)是调控绒毡层后期发育的4个主要转录因子。DYT1是绒毡层开发中最上游的调节剂。DYT1通过直接调节TDF1影响与绒毡层发育和花粉壁形成相关的许多下游基因[41]。TDF1直接调节AMS，AMS调节MS188，MS188调节MS1[42-43]。因此，这些转录因子在控制绒毡层发育中形成遗传途径(DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1)。MALE STERILITY188(MS188)及其直接上游调节因子ABORTED MICROSPORES(AMS)是对于绒毡层发育必不可少的2种转录因子。MS188是在绒毡层中表达的MYB转录因子，其直接调节多克隆合成酶A(PKSA)、PKSB、MALE STERILE2(MS2)和CYTOCHROME P450基因(CYP703A2)的表达。在遗传途径中，AMS可以在体内与CYP703A2、PKSB、TKPR1和CYP704B1的启动子结合[44]。AMS突变体显示异常增大的绒毡层细胞和败育的小孢子[45-46]。

3.2 bHLH转录因子与植物花粉败育型雄性不育

碱性-螺旋-环-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)转录因子家族在动植物中广泛存在。其结构域大概由60个氨基酸组成，包括碱性(Basic)区域和螺旋环螺旋(HLH)区域，碱性区域位于bHLH结构域N端，主要与DNA结合有关；HLH区域分布在bHLH的C端，主要由疏水氨基酸残基构成，利于HLH之间相互作用形成二聚体[47-48]。bHLH转录因子碱性区域的某些氨基酸能够与基因启动子区域的E-box(5′-CANNTG-3′)结合，从而调控靶基因的表达[49-50]。

目前，已报道的与花粉形成相关的bHLH转录因子大部分参与小孢子或者花药绒毡层的发育过程。已有研究结果表明，bHLH转录因子的功能异常引起的不育植株在败育特征上具有相似性，即表现出绒毡层细胞提前或延迟降解，导致花粉形成受阻败育。已经鉴定出来的参与小孢子发育的bHLH转录因子集中在模式植物拟南芥(AMS、DYT1)[51-53]、玉米[54](MS32)、水稻[55-58](TDR1、EAT1、bHLH142等)等植物中。在拟南芥中，bHLH家族成员GLABROUS3(GL3)和TRANSPARENT TESTA8与MYB家族成员TRANSPARENT TESTA2、GL1和MYB61相互作用以调节二氢叶绿酸还原酶和LEUCOANTHOCYANIDIN氧化酶在花青素合成中的表达[59-60]。GL3-GL1复合物也是根表皮和毛状体发育所必需的[61-62]。bHLH-MYB复合物调节茉莉酮酸介导的雄蕊和种子成熟[63]。bHLH家族成员MYC2与MYB2相互作用以调节脱落酸诱导途径的基因表达[64-65]。在花药发育期间，其他3个bHLH家族成员(bHLH010、bHLH089和bHLH091)也参与绒毡层发育和雄性可育[66-67]。酵母双杂交测定显示MS188也与AMS和bHLH010相互作用。因此，MS188或其他MYB可与AMS或其他bHLH形成不同的组合以调节相对孢粉质合成基因的表达。MS188和其他MYB在激活CYP704B1、ACOS5、TKPR1和TKPR2的表达中起着冗余作用。其中，AMS对于TKPR1的表达至关重要，因为它不能通过MS188在AMS突变体中恢复。AMS和其他bHLH也可参与激活CYP704B1、ACOS5和TKPR2的表达。MS188对于激活CYP703A2、PKSB、PKSA和MS2的表达是必需的。由于MS188在AMS突变体中部分恢复CYP703A2和MS2的表达，因此AMS是重要的，并且其他bHLH在调节它们的表达中发挥部分冗余作用。对花粉发育相关bHLH蛋白进行同源性分析发现，不同物种间参与小孢子发育bHLH转录因子具有高度同源性。因此，分析比较这些bHLH转录因子结构特点与功能特征，对于挖掘番茄等其他植物参与花粉形成的bHLH转录因子的功能具有重要意义。

3.3 AMS基因与花粉败育型雄性不育的关系

AMS为败育小孢子基因，首先发现于拟南芥，是影响花药绒毡层和小孢子发育的关键基因，调控花药细胞分化的一个关键调控因子[68]。

花药发育过程中，AMS是花粉壁合成的关键因子，bHLH类转录因子，对AMS基因突变体进行形态学分析，其突变体能够形成绒毡层，导致绒毡层和中层细胞在小孢子母细胞减数分裂时期扩大化，正常的程序性死亡(PCD)过程受阻，阻碍小孢子母细胞的正常发育，不能正常形成花粉外壁，最终导致花粉败育，进而导致雄性不育[69]。番茄是较易进行基因工程操作的重要蔬菜作物，基因组较小，是一种理想的模式植物，是最早开展基因转化研究的高等植物之一[70-71]。

许杰等从形态学、分子生物学、遗传学以及宏观调控网络等不同层次对AMS的功能进行深入分析，结果表明，AMS是花药发育的一个关键承上启下调控因子，是绒毡层细胞的程序性死亡和花粉外壁发育所必需的，是绒毡层发育调控网络中的重要组成部分，其研究结果对于阐明植物花药发育和花粉形成的分子机制具有重要意义。植物花药花粉发育的分子生物学及雄性不育机理的研究，使雄性不育基因工程得以实现。中山大学张宏将花粉绒毡层细胞特异表达的启动子TA29与核糖核酸酶基因构建成嵌合基因转入番茄子叶获得了具有番茄雄性不育特征的转基因番茄。通过基因共表达(co-expression)分析和调控网络(network)的构建等生物信息学工具，在全基因组水平上寻找AMS直接调控的基因，及AMS在绒毡层的细胞性程序死亡过程和花粉外壁形成的调控机理，同样表明AMS在脂类肽链的合成、修饰、运输及小孢子外壁蛋白合成等各个方面，来完成对花粉外壁发育的调控。Sheng等快速定位和鉴定了甜瓜中的ms-5基因，AMS基因被鉴定为雄性不育候选基因[72]。杨仲南等利用SRDX显性抑制试验揭示了MYB家族转录因子MS188可能与同家族的转录因子一起调控孢粉素合成基因表达，结果表明，在绒毡层中，AMS直接调控MS188表达并与之相互作用，AMS也能结合在孢粉素合成基因启动子上。AMS与MS188形成正馈回路调控孢粉素的快速合成[36]。Shen等发现CaAMS优先在四分体和早期-中期单核阶段的绒毡层中表达。CaAMS的下调导致辣椒花部分花丝缩短、萎缩、不裂的雄蕊和败育的花粉。参与花粉外壁形成的几个基因在CaAMS-沉默的花药中被下调。这些结果表明CaAMS通过调节复杂的遗传网络在辣椒绒毡层和花粉发育中起重要作用[73]。

所以，通过AMS基因创造番茄雄性不育，基因工程雄性不育番茄的获得植物花粉花药发育的分子生物学及雄性不育机理的深入研究，使雄性不育基因工程成为现实。

4 物质能量代谢与番茄雄性不育

在番茄雄性不育突变体中，不育雄蕊中可溶性蛋白含量降低，合成缓慢而且伴有特异蛋白的降解。蛋白质总含量和可溶性蛋白含量均低于可育花粉。淀粉物质积累是许多植物花粉的特征。脯氨酸是花粉中氨基酸的一种储藏形式，可转变为谷氨酸等其他氨基酸，脯氨酸在花粉中与碳水化合物互相配合，提供营养来促进花粉发芽、花粉管伸长。富含游离脯氨酸是正常花粉的一个重要特征。在番茄不育花药中，脯氨酸含量下降，对不育花粉外源施加脯氨酸也不能恢复育性。Smith等[74]通过差异性筛选在绒毡层中克隆了一个基因108，只有在减数分裂的晚期才开始表达，表达峰值出现在花芽长8～9 mm时。为基因的表达可能与绒毡层的物质代谢、花粉外壁蛋白沉积及营养供给有关研究提供了证据。另外，王柏珂等[75]以番茄雄性不育系材料，通过同源克隆方法，克隆4个雄性不育候选基因，其中有3个候选基因在雄性不育系与可育系之间发生了突变。通过生物信息学分析发现的第一个基因Solycg001是一个剪切体蛋白基因;第二个基因Solycg002是一个淀粉与蔗糖代谢通路中的酶;第三个基因Solycg003是一个核糖体基因。根据前人的研究,确定了植物的雄性不育是由于淀粉及可溶性糖的代谢异常引起的,初步判断第二个基因Solycg002(序列全长为2473 bp，3个位点发生单位点突变,分别是1194处C替换为A、1211处A替换为G、1529处T替换为C)为不育目标基因，该基因突变可导致淀粉及其他可溶性糖的代谢紊乱。在Xu等的研究中，观察到AMS能够通过直接结合PKSB、TKPR1、CYP98A8和CYP98A9的启动子而触发孢粉质前体，羟基化α-吡喃酮和酚类化合物的形成；拟南芥CYP98A8和CYP98A9显示在绒毡层细胞中表达并且是氧化苯酚酰胺形成所需的；PKSB/LAP5和TKPR1/DRL1编码产生羟基化α-吡喃酮聚酮化合物的酶，其被认为是孢粉质单体；PKSA和PKSB编码植物型III聚酮化合物合酶，其催化丙二酰辅酶A和β-羟基化脂肪酰基辅酶A缩合以产生三-和四-酮基α-吡喃酮化合物。PKSA和PKSB特异性地在绒毡层细胞中瞬时表达，并且PKSA和PKSB突变体缺乏明显的外壁，导致完全的雄性不育。新出现的证据表明，花粉涂层EXL与GRP结合在授粉的最初步骤中发挥作用，即对柱头的水合作用。另外，还发现AMS直接调节花粉外壳蛋白EXL和GRP的表达，这些蛋白涉及花粉外壁和花粉层形成以及随后的授粉。简而言之，这些数据支持AMS在花粉发育过程中的多样化和关键作用，其中包括在小孢子母细胞分离中的直接转录调节作用，四分体愈伤组织的溶解，以及随后在生物合成和花粉层形成中的孢粉[76]。

5 结语与展望

从现有的研究来看，花粉败育是一个极其复杂的发育过程。随着生命科学技术快速发展，科学家们对番茄雄性不育的研究已经从形态学、细胞学、生物化学逐渐转向分子生物学领域。目前利用形态学标记、分子学标记，将各种不同类型的番茄雄性不育基因定位到各条染色体上。参考已测序番茄品种全基因组序列确定区间候选基因，对候选基因进行克隆，挖掘突变位点并通过生物信息学分析候选基因的功能机理，筛选不育目标基因，为番茄雄性不育的研究及应用提供理论依据。本课题组也在研究番茄花粉不育相关基因，通过对目标基因克隆及序列分析、转化等工作，进一步解析番茄花粉花药调控机制。相信随着雄性不育研究的不断深入，必将推动我国番茄花粉败育型雄性不育研究发展。