多浪羊非繁殖季节同期发情、妊娠及激素水平的观察与测定

常 璐,牛志刚,王 刚,肉司旦·有力瓦司,艾山·买买提,林嘉鹏,史洪才*

(1.石河子大学 动物科技学院,新疆 石河子 832003;2.新疆畜牧科学院 农业部家畜繁育生物技术重点开放实验室,新疆 乌鲁木齐 830026;3.新疆五征绿色农业发展有限公司,新疆 麦盖提 844600;4.新疆麦盖提县畜牧兽医站,新疆 麦盖提 844600;5.新疆麦盖提县种羊场,新疆 麦盖提 844600)

0 前言

绵羊的繁殖力是一个极其复杂的性状,受遗传、环境和饲养管理条件等多种因素的影响,其中遗传是最主要的影响因素,内分泌也起到重要作用。研究者发现骨骼形态发生蛋白受体IB基因(bone morphogenetic protein-IB,FecB)是绵羊多胎的主效基因[1]。在FecB基因外显子6上发生A746G突变,这个突变造成编码蛋白质的氨基酸发生了改变,影响了下游控制卵泡发育基因的表达,从而影响母羊卵巢中大量有腔卵泡早熟及排卵数增加[2]。在哺乳动物的发情过程中,控制卵泡的发育是调节动物发情周期的关键因素。雌性动物的性周期和生殖活动受下丘脑-垂体-促性腺激素轴的调控。不同繁殖时期的生殖激素分泌水平不同,而生殖激素水平的差异影响动物的繁殖力[3]。

多浪羊是新疆南疆地区的一个优良的肉脂兼用型地方绵羊品种,具有体格大、早熟、产肉率高的特点。多浪羊母羊在四季均可发情,平均产羔率为113%～130%。羔羊在早期生长发育快,周岁时期的单、双羔羊体重几乎没有差异,是典型的适宜农区生产的理想品种。多浪羊群体存在多胎主效基因FecB突变,该突变引起了多浪羊产羔数的增加[4]。近年来,利用同期发情技术能有效提高繁殖率和生产管理水平,使母羊在一定时间内集中发情、集中配种、集中产羔。但关于多浪羊同期发情后相关激素水平的测定暂时未见相关报道。我们在非繁殖季节研究了FecB不同基因型多浪羊,在外源激素同期发情处理的基础上比较了FecB不同基因型母羊同期发情效果,测定了与绵羊繁殖有紧密关系的E2、P4、LH、FSH的浓度,以期为合理利用FecB基因培育多浪羊高繁殖力品系提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验羊的选择、管理和分组

于2018年7～9月,在新疆喀什麦盖提县多浪羊良种繁育中心挑选健康、膘情中等的多浪羊母羊174只,年龄1～2岁。其中B+型母羊49只,++型母羊125只。种公羊选2岁以上、健康、性欲旺盛、精液质量好的成年公羊;试情羊选用有配种史、性欲旺盛的本地公羊。

1.2 实验药品和材料

羊用孕酮海绵栓(CIDR,新西兰Inter Greaulane公司)、注射用绒促腺素(HCG,宁波市三生药业有限公司)、孕马血清促性腺激素(PMSG,宁波市三生药业有限公司)。生理盐水、酒精、碘酒、高锰酸钾粉、青霉素、新洁尔灭、采精内胎和外壳、开膣器、输精枪、1 mL注射器等均为国产。根据ELISA试剂盒说明书(Abcam,上海)进行检测。

1.3 同期发情实验羊的处理

本试验采用单因素设计,共设2个组,在母羊生殖道内均埋置海绵栓,在放栓期间观察母羊阴道有无炎症反应,若有脓性分泌物并伴有黏膜潮红和出血现象时,则应给予治疗。在第11天于臀部肌肉注射孕马血清330 IU/只；在第13天早上撤栓；在发情12 h后于臀部肌肉注射人绒毛促性腺激素0.1 mg/只。

1.4 母羊发情的鉴定

在早上和傍晚气温较低时,将戴有试情布的多浪羊公羊放到母羊圈各试情1次,如果母羊出现摇尾、外阴部肿胀、接受爬跨、分泌黏液则为发情表现；每间隔12 h试情1次,连续试情3 d；在60 h内发情视为同期处理有效,记录每只羊从撤栓到发情的时间间隔,集中饲养。

1.5 人工授精

采集健康公羊的精液,进行质量检查。分别在母羊发情后的12 h和24 h，采用开膣器法,于子宫颈口输入鲜精0.1 mL。

1.6 母羊妊娠的鉴定

在发情母羊人工授精60 d后，用兽用B超直肠检查进行妊娠诊断，判定是否受孕,统计受胎率。

1.7 血样采集和激素浓度的测定

挑选发情症状明显的多浪羊母羊89只,其中B+基因型32只,++基因型57只,对每只母羊在撤栓、发情0 h、发情12 h和发情24 h时空腹静脉采取血样2 mL,在室温下静置4～6 h,以3000 r/min离心15 min,分离上层血清于1.5 mL的离心管中,应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定发情期经产母羊血清中雌二醇(Estradiol, E2)、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone, FSH)、促黄体素(Luteinizing hormone, LH)和孕酮(Progesterone, P4)的浓度。根据ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.8 数据统计分析

应用SPSS 22.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA)对发情率、受胎率数据进行卡方检验;应用SPSS 22.0中的重复测量数据分析和单因素ANOVA分析方法对不同FecB基因型绵羊外周血中E2、FSH、LH和P4浓度的测定数据进行差异显著性评估,结果以平均值表示。

2 结果与分析

2.1 不同FecB基因型母羊在各时间段内同期发情效果

在埋栓过程中,均没有出现掉栓现象。由表1可知：B+和++型多浪羊组在60 h内的总发情率分别为83.67%和85.60%,差异不显著；B+型多浪羊的发情时间集中在24～48 h内,期间内的发情率为73.46%；++型多浪羊的发情时间集中在24～36 h,发情率为75.2%。

2.2 多浪羊人工授精受胎率情况

由表2可见,经人工授精后，++型多浪母羊的受胎率为67.29%,B+型母羊的受胎率为65.85%,差异不显著。

2.3 不同FecB基因型多浪羊血清中FSH、LH、E2和P4浓度的比较

2.3.1 FSH浓度的比较 从表3可以看出:在撤栓、发情0 h、12 h和24 h时,不同FecB基因型多浪羊在4个时间点血清中FSH浓度均表现为B+型高于++型,但差异均不显著。

表1 不同FecB基因型母羊在各时间段内同期发情效果 %

注:受试B+和++型多浪母羊的总数分别为49和125只。同一列数据后附相同字母表示差异不显著，附不同小写字母表示差异显著(P<0. 05),附不同大写字母表示差异极显著(P<0. 01)，下同。

表2 多浪母羊经人工授精后受胎率情况

表3 B+型与++型多浪羊血清中FSH浓度的比较 IU/L

2.3.2 LH浓度的比较 从表4可以看出：各时间点血清中LH浓度均表现为B+型高于++型,但在不同基因型组间均无显著性差异。

表4 B+型与++型多浪羊血清中LH浓度的比较 ng/L

2.3.3 E2浓度的比较 由表5可知：B+型在观察期内4个时间点的分泌水平都高于++型,其中在撤栓和发情0 h两个时间点,B+型血清中E2浓度极显著高于++型的(P< 0.01)；B+型血清中在4个时间点的平均E2浓度也极显著高于++型的(P<0.01)。

表5 B+型与++型多浪羊血清中E2浓度的比较 ng/L

2.3.4 P4浓度的比较 由表6可知：在发情0 h、12 h和24 h时，B+型血清中的P4浓度均高于++型的,但差异不显著；在撤栓时B+型血清中的P4浓度极显著高于++型的(P<0.01);对4个时间点的平均P4浓度而言,B+型显著高于++型的(P<0.05)。

表6 B+型与++型多浪羊血清中P4浓度的比较 pmol/L

3 讨论

3.1 FecB不同基因型多浪羊同期发情效果比较

绵羊FecB基因实际上为骨骼形态蛋白IB型受体(FecB)基因。研究表明,由于Q249R氨基酸替代使FecB与其配体结合能力降低,导致其功能部分丧失,最终导致绵羊排卵率和产羔数的增加[5]。史洪才等在2011年首次在新疆多浪羊群体中发现了FecB突变并且验证了其与产羔数的关联性,发现B+型多浪羊的产羔数均值比++型多0.51只(P<0.01)[4]。本研究选取空怀多浪羊母羊174头做同期发情处理,其中B+型多浪羊49只,结果显示：B+和++型多浪羊在60 h内的总发情率分别为83.67%和85.60%,前者略低于后者,但差异不显著；与++型多浪羊相比,B+型多浪羊的发情时间长。因此对多浪羊进行海绵栓配合激素实施同期发情处理时,建议延长B+型多浪羊的配种时间。此外，++型母羊的受胎率为67.65%,B+型母羊的受胎率为65.85%,说明受胎率不受FecB基因突变的影响。B+型个体作为父、母本往往在育种过程中被选用于扩繁群体,因此在生产实践中畜牧工作者需要针对B+型个体的特殊情况来制定不同的配种和繁殖策略。

3.2 多浪羊FecB不同基因型同期发情激素浓度的变化

生殖激素与绵羊性器官、性细胞、性行为的发生和发育以及发情、排卵、妊娠、胚胎发育、分娩、泌乳等生殖活动有着密不可分的联系。FSH和LH是参与并调节卵泡发育和窦状卵泡排卵的重要激素[6]。2008年高立坤等发现高繁殖力的济宁青山羊血浆中FSH浓度较高,在全年各月份和4个季节中均高于低繁殖力的沂蒙黑山羊，但差异不显著[7]。不同FecB基因型母羊的外周血中LH浓度没有显著性差异,但BB型母羊的LH脉冲幅度有时较高,而在不同基因型绵羊间LH脉冲频率相似,因而BB型母羊仍倾向于具有较高的LH水平[8]。本试验在多浪羊群体中发现,B+型在观测期任何时间点的FSH和LH浓度都高于++型,但在两种FecB基因型群体间差异不显著。FSH和LH是促进卵泡发育和排卵的主要激素,其中LH在卵泡选择性发育过程中起主要作用,血液中LH基础浓度的高低与母羊排卵数的多少有关系[9-11]。由于不同的FecB基因型绵羊在排卵数表型上表现差异显著,推测FecB基因突变后可能会导致FSH和LH激素的大量分泌。后来,研究者们又证明了FecB基因突变并不一直影响FSH和LH的分泌[12-13]。FecB不同基因型多浪羊血清中的FSH和LH浓度均差异不显著,说明携带FecB基因的绵羊可能对FSH和LH激素更为敏感[14-15]。

E2是卵巢分泌的一种类固醇激素,与卵泡发育密切相关。卵子发育对发情时的E2高浓度水平有积极的反馈作用,而E2浓度的下降对配种后促进胚胎着床和维持正常妊娠活动有重要作用。Bartlewski等[16]研究发现高繁殖力Finn羊相比于低繁殖力Finn羊,血清中存在更高的E2浓度,且差异极显著(P<0.01)。杨华等[17]对FecB不同基因型多胎萨福克羊外周血中生殖激素水平进行测定时发现,发情期多胎萨福克母羊的FecB基因突变使E2水平升高。本试验结果表明B+型多浪羊群体在观察期的E2浓度极显著高于++型群体的,与上述研究结果一致。

P4是由黄体和胎盘产生的类固醇类激素,与E2协同作用促使母畜表现出发情。FecB基因编码区突变,改变了骨骼形态发生蛋白在绵羊卵巢中的信号传递机制,影响其天然配体BMP4和GDF5对孕酮产生抑制的作用,相比于++型,B+型的颗粒细胞对于GDF-5和BMP-4的刺激敏感度较低,导致分泌更高的孕酮水平[18],结果导致颗粒细胞的分化速度加快,进而促进卵泡成熟,排卵数增加[19]。McNatty等[20]发现不同FceB基因型中BB型母羊的血清中P4水平较高。我们选择的母羊没有BB型,但B+型P4浓度较高。在山羊卵巢中P4浓度高,更容易产生小卵泡[21-23]。在本试验中,FecB不同基因型多浪羊血清中P4水平呈显著差异,推测B+型在发情周期的卵泡发育中起到重要作用,使卵巢可能倾向于产生更多的成熟体积较小的卵泡。

4 结论

在非繁殖季节,对不同FecB基因型多浪羊用CIDR+PMSG+HCG进行同期发情处理,同期发情效果及受胎率不受FecB基因突变的影响。FecB基因突变对不同基因型多浪羊外周血中生殖激素E2、P4的分泌水平有显著的影响,但不影响FSH、LH的分泌。FecB基因突变研究结果可为合理利用FecB基因培育多胎肉羊提供科学依据。