抗菌肽及其在水产养殖业的应用（一）

文/王玉堂

在治疗动物的细菌性、病毒性等疾病过程中，因长期和大量使用抗生素，使得某些病原体对药物产生了较强的耐药性（抗药性），而导致无法有效治疗或控制疾病。研发新型抗生素的周期长（一般30年为一周期）、难度大、费用高，另一方面因水产养殖业中抗生素耐药菌株的出现速度远超过抗生素的研发速度，现有的抗生素开发策略多局限于既有的抗生素类别，难以有实质性的突破，一种新的抗生素出现不久就会有病菌产生耐药性。抗感染形势的严峻性迫切需要寻找出与现有的抗生素机理完全不同的新型抗菌物质。而抗菌肽作为一种新型高效的抗菌药物，由于其分子量小、水溶性好、抗菌谱广、作用机制特别、不易产生耐药性等优点，成为新型抗生素开发的良好选择。

抗菌肽的发现，尤其是抗菌肽对耐药致病菌有良好的杀灭或抑制作用为治疗相关疾病提供了一个新的途径。抗菌肽是精准的氨基酸片段，是广泛存在于细菌、植物、软体动物、两栖类动物、鱼类、鸟类和哺乳动物体内的一类小分子多肽，由20个～60个氨基酸残基组成；由两个氨基酸以肽键组成的肽称为“二肽”，由多个氨基酸组成的肽则称为“多肽”，因氨基酸组分和顺序各不相同而组成不同的肽。通常10肽以下者较具医药及商业价值。抗菌肽具有活性强、功能广泛、广谱杀菌作用，在应用研究中有重要价值，这一新领域已引起越来越多研究者的关注。抗菌肽合成的速度非常快，与以恒定速度合成的肽键相比，抗菌肽的生产比IgM快100多倍，因此称抗菌肽是机体理想的第一道防线，目前已有多个鱼类抗菌肽基因不仅被分离出来，还在活体内对其进行了表达。

一、抗菌肽的来源、结构与分类

抗菌肽最开始被定义为昆虫体内神经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质。早在1972年，Boman等研究北美天蚕免疫投机时，发现惜古比天蚕（Hyalophoracecropia）在受外界条件刺激后，其免疫血淋巴细胞产生了一种具有抑菌作用的多肽物质，该物质随后被命名为天蚕素（Cecropin）。此后，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物及至人体中分离到多种具有抗菌活性的多肽物质，至今已分离到2000多种。1986年，Lazarovici等从石纹豹鳎（Pardachirus marmoratus）的皮肤中分离到一种名为豹鳎毒素（Pardaxin）的抗菌肽，这是首次发现并报道的鱼类抗菌肽，迄今为止已克隆和鉴定了150多种鱼类抗菌肽。鱼类抗菌肽与其它物种的抗菌肽相比杀菌作用更强，但同源性较低，种间差异大。

抗菌肽属于小分子多肽，其结构复杂多变。研究发现，不同抗菌肽在肽链长度、序列组成以及生化结构上都有显著差异，但通常具备两个共同特点：一是抗菌肽属于阳离子多肽；二是抗菌肽具有两亲性结构（亲水性和亲油性），疏水性氨基酸残基包括丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸，亲水性氨基酸至少含有2个带正电荷的氨基酸残基、精氨酸或赖氨酸，因为精氨酸和赖氨酸的存在通常带有2个～7个净正电荷，表现出较强的阳离子特征。翻译后的修饰如二硫键的形成、C端酰胺化、N端形成焦谷氨酸以及较少的糖基化，有助于某些抗菌肽维持稳定性和活性。此外，单个抗菌肽的多个亚型是由N-末端的改变而生成。一旦前肽产生，便可通过蛋白水解过程加工释放具有生物活性的多肽，这种蛋白水解过程取决于分泌抗菌肽的组织或细胞类型。由于抗菌肽属于具有两亲性的阳离子多肽，因此，它们的疏水性、正电荷网络、柔性构象以及二级结构都相互影响着它们的生物功能。

按照来源，抗菌肽可分为动物、植物、昆虫、真菌、细菌来源的抗菌肽。按照其功能可分为抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫和抗肿瘤抗菌肽。按照其结构可分为线性α-螺旋肽（此类抗菌肽由于富含一些碱性氨基酸而带正电荷，作用于细菌细胞膜时，可与细胞膜相互折叠，形成一个可以穿透细胞膜的疏水结构，如天蚕素、蛙皮素等）、含有两个或两个以上以二硫键且具有β-折叠结构的抗菌肽（如Hepcidin、Leap2、β-defensin等）、呈环状结构的抗菌短肽（如Cyclopsychotride）、散乱结构的扩展肽（该类抗菌肽目前较为罕见，以Bacterianecin抗菌肽为代表）、由其它已知功能的多肽衍生的具有抗菌活性的肽类物质五大类。目前报道的鱼类抗菌肽在氨基酸序列上无较大的同源性，但是，其具有相似的结构和共同的特征，如下载电荷、两亲性和疏水性等。

二、鱼类抗菌肽的生化特点和组成

鱼类抗菌肽是一类小分子蛋白质，其组成和结构复杂多样，分子量大小和氨基酸组成各不相同，但它们根据一定特点所组成，如含有较多的半胱氨酸，形成较保守的α-螺旋结构；含有较多的阳离子氨基酸如精氨酸或赖氨酸等而使分子带正电荷。根据其生化和结构特点，可将它们分成若干类型：

第一类：富含某种氨基酸的线性抗菌肽。此种类型的抗菌肽因富含一些碱性氨基酸而带正电荷，与细菌细胞膜相互作用时可以折叠成有利于穿膜的疏水或双亲性α-螺旋结构，能选择地作用于细菌外层细胞膜的某些部分，如带阳离子的磷脂，增大其渗透性而杀死或抑制细菌的生长。这类分子还包括来源于虹鳟血清的salmocidin；八目鳗小肠的HFIAPs（hag fi sh intestinal antimicrobial peptides）；分离自泥鳅的misgurin；来源于杂交斑纹鲈皮肤、鳃和血液肥大细胞的piscidins以及分离自美洲拟鲽和豹鳎体有粘液的pleurocidins和pardaxins等，其中Brocal I，Falco A等人从刺泥鲽的皮肤粘液中分离出一种25氨基酸的线性抗菌肽pleurocidin（Ple），具有与其它许多抗菌肽类似的两亲性、α-螺旋结构的鲈鱼的皮肤和鳃可表达分泌的moronecidin抗菌肽。鲈鱼moronecidin前体有79个氨基酸残基，由信号肽、成熟肽和C片段3部分组成，氨基酸残基数分别为22、22和35。经圆二色谱分析其结构呈α-螺旋。

第二类：含多个半胱氨酸分子内形成环状的抗菌肽类，这类抗菌肽由于含多个半胱氨酸而形成多个二硫键，从而使其二级结构呈β折叠。这类分子包括来源于罗非鱼的hepcidin和从克海七鳃鳗的皮肤上分离到富含半胱氨酸和精氨酸的多肽LCRP（lamprey corticostatin-related peptidi）等，其中hepcidin基因大概含有20个～25个氨基酸残基，内部有8个高度保守的半胱氨酸，形成4个分子内二硫键，它有3个外显子和2个内含子，其中有1个长为273bp的ORF顺序，编码1个含有90多个氨基酸残基的前多肽原；前多肽原包含3个区域，信号肽、成熟肽和由40个氨基酸残基构成的前hepcidin原。罗非鱼hepcidin原类型目前报道的有3种，分别命名为TH1-5、TH2-2和TH2-3，前体肽分别有88、86和91个氨基酸残基，相对分子量分别为9.5、9.4和9.8ku；三信号肽裂解位点分别位于第24～25、第22～23和第24～25密码子上，在共同的保守区域，都含有8个半胱氨酸。罗非鱼中的TH2-3和日本鲽鱼的JF2相似，TH2-2和日本的JF1相似，TH1-5和鲷的hepcidin类似；通过晶体结构模型表明，在半胱氨基酸部位都形成二硫键。从斑马鱼分离到的β-defensins有3种，分别命名为zfDB1、zfDB2和zfDB3。与哺乳动物β-defensins相同，三者的成熟肽都有6个半胱氨酸，形成3个二硫键，并形成的模式一致，即第1～5、第2～4和第3～6个半胱氨酸。结构都呈β折叠，但zfDB1的N端有1个α-螺旋结构。

第三类：组蛋白样抗菌肽（histone-like proteins，HLPs）。这类肽在水生动物中仅发现于鱼类中，虾类、贝类中尚未见报道。如从鲶、斑纹鲈鱼、银大马哈和鲑等的皮肤粘液、鳃、血液和肝脏中分离的parasin I、HLPs和SAM等，氨基酸序列和质谱分析表明，它们与组蛋白H2A、H2B和H1非常相似。从大西洋鲑皮肤粘液中分离的SAMP H1（samonantimicrobial peptide H1）含有30个氨基酸残基，中间富含Pro，N端乙酰基化，但对其抗菌活性没有影响；理论上的相对分子量为2836u。经圆二色谱分析，其活性形式比非活性形式分子结构上显得紧凑和更具刚性。从鲋鱼红细胞上分离得到的一种特异蛋白H1与SAMP H1的氨基酸顺序有78%的同源性，有3个信号肽切割位点，是鲋鱼红细胞上一种新发现的抗菌肽。从鲶鱼受伤皮肤粘液分离得到的parasin I是由H2A组蛋白经酶cathepsin D在其N端Ser19-Arg20位置裂解作用后产生的一种抗菌肽。parasin I含有19个氨基酸残基，具有广谱抗菌活性。Jorge等从彩虹鲑鱼皮肤分泌物中分离提取了1种新的抗菌肽Oncorhyncin Ⅱ，指出这种抗菌肽的前17氨基酸残基与来自彩虹鲑鱼组蛋白H1的前138～154个残基相同，并测得其分子量为719513Da。从而指出这个Oncorhyncin Ⅱ抗菌肽是组蛋白H1的C末端69残基的片段。从鳕体表粘液中分离得到的几种抗菌肽活性因子，通过弱阳离子的交换色谱法和反相色谱层析技术，分离出来3种小肽，通过N端和C端氨基酸顺序分析和质谱分析，它们分别为核糖肽类L40（6397Da）、L36A（12340Da）、L35（14215Da）。

第四类：经酰胺化、糖基化修饰的抗菌肽。这类肽由核糖体合成后，在高尔基体浓缩、加工时，在相关酶的作用下脱掉C端1个或多个氨基酸，或再与一些糖基结合而成有活性的成熟肽。这类肽在虾类和一些海水鱼类中比常见。如从健康的南美白对虾血细胞和血浆中分离出了几种抗菌活性因子，通过酶剪切、Edman降解、质谱仪分析等方法以及从血细胞的cDNA库中进行cDNA克隆，测定序列，发现南美白对虾抗菌肽penaeidins具有其中一种肽的N端因形成焦谷氨酸而封闭；C端由于谷氨酸在成熟肽中被去掉而酰胺化等等。但由于它们的N一端富含脯氨酸。而C一端含有6个半胱氨酸组成的3个分子内二硫键，使它们的结构有别于其它类群的抗菌肽。还有从鲤体表粘液中分离出的27KD疏水蛋白和从丁鲷和鳗鲡皮肤粘液中分离出的分子量分别为65KD、49KD和45KD3种抗菌肽也是经糖基化修饰的多肽。Jorge等从彩虹鲑鱼的皮肤中分离出的一种新的具有抗菌功能的核糖肽类，测得其分子量大小为667616Da，并指出这种肽与40S的核糖体蛋白S30非常相似。Jorge等还从彩虹鲑鱼的血细胞中分离出的具有抗菌特性的活性片段，研究得出这种活性片段对热敏感，且能被蛋白酶所消化，从而推断这一活性片段为一种类似蛋白质的具有抗菌活性的天然成分。

三、鱼类抗菌肽的基因结构和功能

随着研究的深入，一些抗菌肽基因被陆续克隆。2006年，刘碧莲等根据GenBank中收录的鱼类抗菌肽hepcidin的DNA序列设计特定的引物，用RT-PCR法从鳜鱼肝脏中克隆到hepcidin的cDNA，并构建Pmd18-Thepcidin载体进行序列测定和分析，结果表明，该cDNA长为381bp，其中第20～277位核基因的开放阅读框（ORF），编码86个氨基酸，形成由信号肽（24个残基）、前肽（42个残基）和成熟肽（20个残基）3部分序列组成的前体肽，与已报道的其它鲈形目鱼类hepcidin相比，核苷酸序列的同源性为72.2%～92.0%，所推导的成熟肽与包括人类在内的其他生物的hepcidin成熟肽的同源性在50%～86.4%。Park等经质谱和化学分析方法研究证实，8个保守的cys残基形成4个链内二硫键，分子呈发夹结构。4个链内二硫键可使β-折叠结构保持稳定。由Campagna S，Saint N等人2007年从条纹鲈的肥大细胞里分离出Piscidin抗菌肽，他们通过采用脂分子双层的结构分析和电生理实验研究了这个包括22个氨基酸残基的阳离子肽的抗菌机制，圆二色性实验发现谱Piscidin在水中是无组织的，但却有1个高度紧密的alpha-helix，8～17个氨基酸残基在微胞环境中具有alpha-helix，由于有界限清楚的疏水和亲水区域，这个分子有两亲性的特性。这种结构和那些能使细菌细胞通透性增强的阳离子肽的结构非常类似。Piscidin混合到偶氮植物凝血素二维的双分子层多通道实验发现，在不同的浓度下会出现1个Ⅰ-Ⅴ曲线，而且非常明确的表明肽分子能使细菌细胞膜通透。这个孔形成的活力通过单通道实验进一步证实了。离子通道的特性更加明确的表明了Piscidin通过螺旋的孔道结构更能使细菌透化，而不是通过“桶-桶板（barrel-stave）模型”。A.Falco等人从鲑科鱼类的EST数据库中调取了虹鳟β-防御素类抗菌肽的顺序称为c.mykiss βdefensin-1(omBD-1)，signal P3.0program分析发现，在omBD-1的19位后有1个假定的切割位点，切割位点后有1个含有41个氨基酸的前体肽和β-防御素共有的顺序一样，也有6个保守的cys残基，它和从其它鱼类中分离到的β-防御素类抗菌肽有85.7%的同源性，同人类有34.9%的同源性；omBD-1有1个正2价的阳离子，等电点为8，这有助于omBD-1与细菌细胞膜的结合。

近年来的研究重点，在于向建立水生动物免疫特异性cDNA文库和表达序列标签（ESTs）方面转移，这将有助于发现更多的抗菌肽基因。Nam等地日本鲽鱼类的cDNA和ESTs文库，从中鉴定了许多免疫相关基因，如Mx蛋白基因、补体基因、干扰素调节基因等；从2种白对虾的ESTs中发现了44个免疫功能相关基因，全部免疫ESTs中，属于抗菌肽的ESTs数量占总数量的60%以上。可见抗菌肽的种类数目非常大，在水生动物中的分布也十分广泛。