细胞自噬与缺氧缺血性脑损伤的研究进展

黄 林 鲁利群

成都医学院第一附属医院儿科，四川成都 610500

新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）是指各类围生期窒息引起部分或完全缺氧、脑血流减少或中断而导致的胎儿或新生儿脑损伤。各类缺氧缺血性事件（胎盘早剥、子宫破裂、脐带脱垂等）是HIE 的主要原因，HIE可导致新生儿残疾和死亡，活产足月儿全球内发病率约为1.5/1000，幸存者中25%～30%留有不同程度智力障碍、癫痫等并发症，约20%患儿在新生儿期死亡［1-2］。随着新生儿重症监护技术提高，HIE 存活率有所提高，但患病率仍无明显降低。因此，明确新生儿HIE 的发病机制，探索防治HIE 新方向十分重要。一直以来，细胞自噬被认为是调节细胞稳态的保护性机制，然而研究表明，它在成人缺血性脑卒中中发挥着双重作用［3］。那么自噬在新生儿HIE 中发挥什么作用呢？本文就自噬的生物特性及其在缺氧缺血性脑损伤发生、发展中的两面性进行文献综述。

1 细胞自噬

1.1 自噬的定义

自噬意为“自己吞噬自己”，这一现象是比利时生物医学家de Duve 于1963 年首次描述，自噬广泛存在于酵母、哺乳类动物等真核生物中，在进化上高度保守［4］。它是高度依赖溶酶体的降解与再循环途径。衰老或错误折叠的蛋白质和受损的细胞器被膜结构隔离包裹，运至溶酶体，降解并产生氨基酸、核苷酸、脂肪酸等可利用的物质。自噬是维持机体自身稳态的重要方式。

1.2 自噬的分类及过程

自噬主要分为三大类型：微自噬、巨自噬、分子伴侣介导的自噬，巨自噬最常见，也是通常所说的“自噬”，主要过程分为诱导自噬、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合及内容物降解。去磷酸化的Atg13 与ULK、Atg101 及FIP200 结合，形成前起始复合物，自噬激活［5］。Beclin-1 通过VPS34-p150 复合体与UVRAG、Atg9、Atg14 等蛋白结合，形成Ⅲ型PI3K 复合物启动自噬，该复合物的中心蛋白是Beclin-1，凋亡相关蛋白Bcl-2 可结合到Beclin-1 上，抑制起始复合物的形成［6］。ULK1 激酶复合物磷酸化Beclin-1 时，Beclin-1 促进PI3K 复合物转变为PtdIns3P，召募Atg8/LC3、Atg7 和Atg5-Atg12-Atg16L1 等相关蛋白到PAS，使自噬囊泡膜延伸和自噬体成熟［7］。最终，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体。其中，LC3-Ⅰ通过Atg3 和Atg7 与PE连接酯化为LC3-Ⅱ，生成的LC3-PE 共轭物是自噬体膜的必要物质［8］，因而，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ常作为自噬标志蛋白。自噬体膜受体蛋白SQSTM1/p62，最终被降解，因此p62 是自噬流标志。

2 脑缺氧缺血后诱发细胞自噬

当机体遭遇饥饿或缺氧缺血等，能量耗竭AMPK被激活，抑制TSC1/TSC2，降低mTORC1 活性，Atg13去磷酸化增强形成前始复合物激活自噬［9-10］。PI3K/Akt是mTORC1 上游信号通路。生理情况，Beclin-1 使PI3K 激活、Akt 磷酸化、mTORCl 激活，从而抑制自噬；脑缺氧缺血后，活化过氧化物酶体增殖物活化受体γ，抑制Beclin-l 进而负性调控mTORCl 活性，增强自噬［11］。此外，Zhang 等［12］发现缺血/再灌注大鼠脑组织中，NF-κB/p53 信号通路参与自噬和凋亡。缺血缺氧时NF-κB 进入胞核，p62 表达增强，抑制p53、Bcl-2表达，LC3-Ⅱ和Beclin-l 表达显著，激活自噬［13］。低氧诱导因子（HIF）1 是缺氧状态下重要转录调控因子，缺氧时HIF-1α 高表达促进Bcl-2/BNIP3 复合物生成，Beclin-1 大量游离，激活自噬［14］。总之，缺氧缺血时，机体有几条不完全独立的自噬激活途径，如AMPK-mTORC1、PI3K/Akt-mTOR、NF-κB 及HIF-1α信号通路等。

3 缺氧缺血性脑损伤与细胞自噬

长期以来，自噬被认为是细胞的一种适应性保护机制，在缺氧缺血、氧化应激等病理情况下，回收再利用废物以制造能量及代谢的基本物质。Su 等［15］首次将自噬抑制剂应用于新生幼鼠缺氧缺血模型，观察到抑制自噬后缺氧缺血后的细胞迅速坏死，提出自噬是一种潜在而普遍的保护机制。但在某些情况下，自噬会导致细胞死亡［16］，一类是自噬诱导细胞死亡或凋亡，另一类是自噬性死亡（Ⅱ型程序性死亡），但它在形态学上独立于凋亡或坏死的死亡途径［15］。

3.1 脑缺氧缺血后自噬的保护作用

在缺氧缺血的大脑损伤过程中，自噬活性对细胞存活十分重要。研究发现［17］，3 日龄新生SD 大鼠脑缺氧缺血后，模型组Beclin-1 表达增加，且与神经元修复的时间窗一致，而Caspase-3 表达趋势则相反，推测自噬参与神经元修复，减轻脑损伤。然而这种保护作用能被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）所阻断［18］。如果在脑缺氧缺血前先低氧预处理，发现通过Rab7诱导神经元自噬体成熟及自噬通量恢复，海马CA1 区自噬体明显增加，脑梗死明显减少，而用氯喹抑制自噬体融合后，其产生的保护作用被抵消［19］。另有研究表明［20］，在大鼠脑卒中模型中，缺血预处理提前激活神经元自噬，可显著减轻细胞凋亡。因此，提前激活自噬可在脑缺氧缺血后发挥保护作用。Sheng 等［21］实验发现，大脑中动脉结扎前，脑室内预注射雷帕霉素或3-MA，前者激活自噬，脑梗死体积、脑水肿、运动障碍减轻，3-MA 组LC3、Beclin-1 表达下降，抑制自噬，脑损伤加重。以上均证明自噬预激活自噬在脑损伤中发挥保护作用。皮质神经元细胞氧糖剥夺（OGD）的48 h，Dai 等［22］用慢病毒转染Sirt3 高表达后，OGD 模型损伤减轻，AMPK 磷酸化水平增加，证实Sirt3 主要通过活化AMPK-mTOR 信号通路增强自噬起保护作用。但该研究局限性在于仅在细胞水平上进行研究，还需要更多的体内实验验证。新生10 d SD 大鼠缺氧缺血的24 h，用氯喹抑制自噬后，脑损伤加重，活性氧（ROS）含量增多，线粒体超氧化物降低，推断自噬抑制介导细胞凋亡加重与缺氧缺血大鼠线粒体功能障碍有关［23］。以上推测，在缺氧缺血不同阶段，激活自噬会产生不同效果，而在发挥保护作用阶段的具体机制暂不明确，需进一步研究。最近研究推测［24］，适度自噬促进细胞存活，而过度自噬加剧细胞死亡。在脑卒中体内外模型中均得到验证，同型半胱氨酸通过抑制PI3KAkt-mTOR 信号通路，导致过度自噬，加重对神经干细胞的毒性［25］。OGD/复氧48 h 以后，3-MA 抑制自噬，神经细胞存活增加。缺氧缺血的晚期阶段，自噬过度激活，自噬扮演损伤的角色。

3.2 脑缺氧缺血后自噬的损伤作用

研究认为，自噬加重缺氧缺血后脑损伤。Descloux 等［26］建立新生小鼠脑损伤模型和神经兴奋毒素鹅膏蕈氨酸培养原代皮质神经元，24 h 后检测到神经元自噬增强，预注射3-MA 不仅抑制自噬，还抑制Caspase-3 的活性，脑损伤明显减轻。体外实验也得到同样结果。提示重度新生儿脑损伤时，抑制自噬可能是潜在的有效策略。同样，七氟醚后处理HIE 大鼠，发现通过ERK 级联抑制大脑过度自噬，减轻脑损伤［27］。所以，自噬可能是缺氧缺血后潜在治疗靶点。虽然自噬与凋亡、坏死在形态学上和分子机制上不同，但在缺氧缺血脑损伤时交叉。它们有共同的分子介质，如AMPK、Bcl-2、p62 等［28］。缺血神经元中，Wnuk 等［29］发现凋亡和自噬均存在，靶向调控自噬后，抗凋亡信号增加，细胞损伤减轻。因此，这两个过程可能存在拮抗或协同。在新生儿HIE 中观察到多种形态的细胞死亡，但在海马CA3 区常见的是形态特征上异于凋亡和坏死的自噬性死亡，而强心苷类药物（Na+/K+-ATPase抑制剂）抑制自噬，减轻自噬性死亡的发生［30］。自噬介导的死亡和自噬性死亡在形态学上容易区分，而互相之间的机制却仍待探索。

自噬性死亡主要通过溶酶体途径发生，在HIE模型中，缺氧缺血可以诱导大量自噬小体产生，24 h 时海马区Beclin-1 和LC3 显著增加，3-MA 抑制自噬后可明显减轻海马损伤［31］。提示自噬可能促进缺氧缺血后脑损伤。但可能是自噬清除不足，也称呼自噬流受损，用氯喹抑制溶酶体后，自噬蛋白LC3 增加，自噬体增加，损伤减轻［32］。另外发现［33］，焦亡与自噬也有联系，慢病毒转染下调NLRP3 炎症小体后，Beclin-1、Agt7 水平下降，而抗自噬蛋白升高，表明其主要是通过抑制自噬发挥保护作用。因此，无论体内外模型，缺氧缺血后自噬是明显增强的。激活自噬大部分发挥着加重损伤的作用。但这与自噬程度、发生阶段、外界因素等相关。并且，自噬会引起自噬性死亡，并和凋亡、焦亡及内质网应激等相互作用，加重组织损伤。

4 小结

自噬调节蛋白功能和体内平衡相当重要。许多体内外实验证据表明，自噬具有两面性。自噬预激活或在缺氧缺血后早期和适度激活时，可以减轻脑损伤，发挥保护作用，而重度缺氧缺血或过度激活时，自噬会和/或其他死亡方式一起，表现负性作用。自噬在HIE 中的角色可能由自噬程度、自噬发生时间以及自噬流受损等因素决定，而如何调节自噬相关特性以减轻缺氧缺血后神经元损伤需进一步探索。此外，自噬抑制剂如3-MA、巴佛洛霉素、氯喹等特异性较低，基于这些药物的实验结果有待验证。自噬相关基因可能发挥与自噬无关的生物功能，因此特异性敲除自噬相关基因得出的结果也是有限的。高度特异性的试剂、更好动物模型的开发有助于研究人员深入理解自噬在疾病中的确切作用。