浅谈如何提高“蔗糖酶酶学性质与酶促反应动力学”实验结果的可重复性

邓祥宜，程占云，方雨婷

（武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北武汉 430205）

0 引言

酶是生物化学的重要内容。其中，酶的酶学性质及酶促反应动力学是教学的重点和难点。开设酶学实验有利于学生在实际操作中充分理解相关知识、掌握实验技巧。学校生物工程、食品科学与工程、食品质量与安全专业的“生物化学实验”课程开设了综合性较强的“蔗糖酶酶学性质与酶促反应动力学”实验。教学中，该实验重复性欠佳，不少小组间测定结果偏差较大；通过多年教学，结合每次实验的情况，笔者分析总结，对如何上好该实验有了一些体会。同时，实验中的关键控制点也可为其他酶学实验的教学和科研工作提供参考。

1 实验主要内容简介

学校生物化学实验使用内部编写的教材，“蔗糖酶酶学性质与酶促反应动力学”实验要求从酵母粉中提取蔗糖酶，催化底物蔗糖水解，通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）法检测产物还原糖的生成量，计算酶促反应速度。通过比较不同温度、不同pH值下的酶促反应速度，确定酵母蔗糖酶的最适温度、最适pH值；在最适温度、最适pH值条件下，通过测定不同底物浓度下的酶促反应速度，绘制双倒数曲线（Lineweaver-Burk曲线），从而求得蔗糖酶的Km值，以及该酶量对应的Vmax。

2 教学的主要目标及问题

实验的教学目标是让学生通过实验现象充分认识温度、pH值、底物浓度对酶活力的影响，掌握测定酶最适温度和最适pH值的方法，以及酶促动力学测定Vmax和Km的方法。但是在上课过程中，常常出现小组间的实验结果不相同，最适温度、最适pH值、Km的测定偏离明显，而且蔗糖酶的最适温度受开课时气温高低影响明显。如何让所有小组的结果趋近于一致，使不同小组的学生都能准确地测定出相关指标，是摆在教师面前的紧迫问题。

3 问题的解决

科学实验必须经得起反复检验，实验不仅要某个人自己能重复做出来，还要不同的人能重复做出来。实验在大二上学期开设，学生专业技能是有限的，不经过上课时的专门强调和有针对性的指导，往往达不到预期目标。笔者经过多年教学的观察和分析，找出了实验的关键控制点，从而提高了实验结果的可重复性，让学生更容易获得成功的喜悦、建立学习的自信。

3.1 关于酶液的制备和稀释

为了增强实验的综合性和模拟真实的研究，实验中要求每个小组从酵母粉中提取蔗糖酶用于该实验，由于每个小组提取液中的蔗糖酶浓度存在差异，导致显色后吸光度偏离有效范围的情况时有发生，甚至导致实验无法按时完成。因此，在实验开课前，由教师通过预实验确定酵母蔗糖酶提取的较好条件：酵母粉添加量（每批酵母粉蔗糖酶活力存在差异，且受存放时间影响）、加水量、研磨时间、稀释倍数等。实验中，要求各组将提取的蔗糖酶交给教师混匀（消除各组提取的蔗糖酶浓度差异，让全班使用相同浓度的酶），再分发给各组单独进行梯度稀释，摸索获得合适的稀释倍数，经教师汇总相关结果后，全班确定统一稀释倍数用于该实验的研究，从而避免了各组酶浓度、稀释倍数差异可能造成的混乱，保证实验均能按时完成。

3.2 酶促反应pH梯度的设置

按照原先的实验设计，酶促反应考查pH值3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，教学过程中，一些小组测定的最适pH值为4.0，也有一些为5.0，经常会有学生问到底最适pH值为多少，哪个是对的，面对这个问题，笔者让学生通过课外兴趣实验测得蔗糖酶的最适pH值在4.5～4.6（一些实验教材中蔗糖酶酶活测定使用pH值4.6[1]），于是将实验的pH值梯度调整为2.6，3.6，4.6，5.6，6.6，7.6，由于pH值4.6处的酶促反应速度显著高于其他值，使得所有小组测定的最适pH值均为4.6，避免了先前pH值4.0，5.0处的酶促反应速度比较接近、难以判断的问题。

3.3 关于酶促反应体系的准确量取与混匀

由于该实验要测定酶促反应产物的多少，属于定量实验，所以反应体系各成分的准确量取是基础，所有学生对于这一点的认识很到位。但在“混匀”这个环节，少数学生会出现问题，造成测定值存在偏差。实验步骤中描述为“混匀”，在操作过程中，酶促反应体系小，其混匀一般比较容易，但是在“还原糖与DNS反应结束后，用水定容至15 mL”这一步，少数学生做完“混匀”操作后，刻度试管中上层液体与下层液体颜色不一致（上层液体往往偏浅），如果此时测定吸光度，取上层液体或者下层液体都不能代表该管的真实吸光度，所以实验中要跟学生再三强调“混匀混匀，不光是混，还要混到‘匀’为止”经过反复强调，并且让学生在测定吸光度前拿给教师检查，解决了“混匀”这一问题。

3.4 关于反应时间和温度的科学控制

由于是定量实验，在反应时间的控制上必须精确，如“还原糖与DNS混匀后于沸水浴中反应5 min”，“酶促反应于37℃水浴锅中反应10 min”等。教师给学生强调的是，计时务必“精确到秒”。实验中，学生在沸水浴中DNS显色、水浴锅中酶促反应的时间控制要格外小心和准确。还原糖测定一般很准确，葡萄糖标曲的R2一般都大于0.995，但不少学生酶促反应的结果却可能很糟糕。原来学生对“精确计时到秒”的理解仅仅是水浴锅中酶促反应的时间，而忽略了加完酶后，在室温下酶促反应已在进行，也忽略了酶促反应结束后从水浴锅中取出试管至加入DNS之前，酶促反应也在继续进行。因此，在教学中，酶促反应的精确计时除了强调“精确计时到秒”，还要强调“严格控制和尽量避免规定温度外的反应时间”。具体操作时，让学生将酶液与反应其他成分分别预热，在混匀的一瞬间开始计时，反应结束后立即取出并加入DNS终止反应。这样，由于反应时间的严格控制和预热操作的执行，所有小组酶的最适温度都为37℃，双倒数曲线的相关系数也达到了0.99左右。

4 结语

相比理论课的教学，学生对实验课具有更大的兴趣，而实验结果的可重复性和准确性影响着学生的学习自信，进而与后来的学习态度密切相关。酶学实验是本科教学中较难的实验内容之一，实验的重现性不太好。笔者在教学实践中找到了酶液制备与稀释、pH值梯度设置、体系混匀、反应时间及温度的科学控制等4个关键控制点，提高了该实验教学的重现性。以往部分学生因实验结果不理想而感觉受挫，进而使其学习积极性和学习自信的情况得到了很好的解决。

对笔者而言，教师不仅是一份职业，更是被当作事业。在多年的“生物化学”教学工作中，观察、学习、思考、总结从未停止，因而在教学中有了一些改进和感悟[2-3]。在将来的工作中，将再接再厉，因为“教师要给学生一碗水，自己要有一桶水”，而“教师要永远装满一桶水，必须要有一眼泉”[3]。