针刺对脑缺血再灌注损伤神经细胞自噬影响的研究概况

孙晓伟，高营，王新宇，刘婷婷，潘婷婷，刘丹，刘勇，陈英华，金弘，李洪涛*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

脑缺血再灌注损伤[1](Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是急性脑梗死再通后常见的病理过程，CIRI后会引发一系列的损伤级联反应，最终导致大量神经细胞损伤或死亡。自噬(autophagy)作为新发现的程序性细胞死亡方式，对于脑缺血再灌注后神经细胞的“存活”与“毁灭”意义重大。一方面适度自噬可帮助细胞清除受损的细胞器和异常折叠蛋白，促进自体修复，从而对神经细胞损伤发挥保护作用；另一方面过度的自噬与凋亡信号存在交互作用，可诱导自噬性细胞死亡、促进细胞凋亡的发生与发展，从而加重神经细胞损伤。因此，明确CIRI后神经细胞自噬的调控机制，通过某些干预手段，促使CIRI后神经细胞自噬的适度激活，进而保护神经细胞、促进神经细胞的自体修复，有望成为CIRI后神经功能重塑的新的治疗思路。

针刺作为中医学的特色疗法，在CIRI防治过程中显示出独特的优势，其稳定和理想的疗效，安全方便的操作已受到了医学界的公认和肯定。对机体可发挥多环节、多水平、多途径的调节作用。越来越多的研究表明针刺对CIRI后诱导的神经细胞自噬有良性的调节作用。本文就国内外关于针刺对CIRI诱导神经细胞自噬影响的相关文献进行综述，以期为临床应用针刺防治CIRI提供全新的科学依据。

1 自噬概述

自噬[2]又称细胞的“自我消化”，是一种细胞经由溶酶体途径参与降解胞浆内受损的细胞器和大分子物质的分解代谢过程，对维持细胞的生存、分化、生长以及稳定具有重要作用[3]。根据自噬的转运方式可分为巨自噬、微自噬以及分子伴侣介导的自噬[4]；根据自噬对降解底物的选择性可分为选择性自噬(线粒体自噬、内质网自噬、过氧化物酶体自噬、核糖体自噬和脂类自噬)以及非选择性自噬[5]。

目前常采用透射电镜、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associatedprotein 1 light chain 3，LC3/Atg8)turnover、绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的抗降解性、P62蛋白、mRFP-GFP-LC3活细胞成像和流式细胞仪等方法检测自噬体及其标志蛋白[6]。透射电镜是观察自噬最直接、最经典的方法，能特征性地表现为细胞质中有自噬体和自噬溶酶体出现[7]。自噬[8]是一个由自噬相关蛋白精密调控的、动态的生物进程，基本过程包括诱导、隔离膜生成与延伸、自噬体的形成与成熟、与溶酶体融合、自噬溶酶体的降解以及小分子循环再利用等步骤，这一过程对细胞清除废物、结构重建起关键作用。

2 自噬与脑缺血再灌注损伤

近年来，大量体外或在体的实验证明自噬参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程，并且影响神经细胞的生存和死亡。Sheng等[9]分别通过自噬诱导剂雷帕霉素及自噬抑制剂3-MA对大脑中动脉阻塞引起的缺血性脑损伤大鼠模型进行预处理和预适应后，观察到缺血大鼠模型的脑梗塞面积、脑水肿程度以及神经功能缺陷三个方面均有不同程度减轻，进而说明自噬对缺血性脑损伤的神经细胞具有保护作用。Carloni等[10]研究也发现在缺血缺氧诱导的脑损伤时神经细胞自噬水平增加，自噬诱导剂雷帕霉素进一步上调自噬水平后可减少坏死性细胞死亡，减轻脑损伤。但也有实验证明，过度的自噬可以诱导神经细胞死亡。CHEN等[11]发现，在特定的环境下，自噬不仅阻止细胞死亡同样也调节细胞死亡，如果自噬破坏细胞质或者细胞器超过一定的阈值，自噬性细胞死亡就会发生。大鼠进行永久大脑动脉栓塞造模，可引起自噬的过度激活，导致自噬性细胞死亡，加重了脑损伤，分别用3-MA抑制自噬和干扰Beclin 1均可减轻大鼠的神经元死亡。因此，在脑缺血/再灌注不同时间窗，通过何种途径启动自噬，发挥其清除作用，又通过何种途径关闭自噬来防止其过度激活，决定着自噬是发挥保护抑或损伤作用，对其相关的分子机制的研究有望为今后该病的防治提供重要的干预靶点[12]。

3 针刺对CIRI神经细胞自噬影响的研究概况

随着现代医学的不断发展，国内外在针刺防治CIRI的临床机制与动物实验研究方面取得了长足进步，从宏观到微观、从系统水平到基因水平均有所涉及。许多研究资料证实[13-15],针刺可增强脑组织超氧化物歧化酶活性；对抗自由基损伤；抑制兴奋性氨基酸释放；减轻免疫炎性反应；降低Ca2+超载；改善脑部血液循环、增加血流量、促进脑微血管功能重建及血脑屏障修复；抑制神经细胞凋亡；促进内源性神经营养因子、神经生长因子的激活与神经干细胞增殖；调控细胞间信号转导等。针刺拮抗CIRI的机制是多方面、多层次的，针刺几乎参与了CIRI的所有病理变化过程，而CIRI后的各种分子学改变是相互影响、相互制约的，针刺正是通过调节这样一个错综复杂的系统而达到减轻CIRI、保护神经细胞的作用。近年来随着对自噬研究的不断深入，大量的实验研究亦表明[16-17]，针刺对CIRI诱导的神经细胞自噬有一定的调控作用。

3.1 针刺对CIRI神经细胞自噬相关蛋白表达的影响

自噬有着相当复杂的分子调控机制，其中Atg6(Beclin-1)、Atg8(LC3)和P62蛋白是自噬发生必不可少的分子[18]。LC3是酵母自噬相关基因Atg8的哺乳动物同源类似物，存在两种可以互相转换的形式,分别为LC3-Ⅱ和LC3-I[19]。LC3-Ⅱ被认为是自噬体形成的标志，与自噬体的形成有着密切的关系，随着自噬体膜的不断增多，LC3-Ⅱ的数量或LC3-Ⅱ/I的比例与自噬体的数量呈正比，在一定程度上反应了自噬的活性[20]。缺血性卒中后3 h，RT-PCR和Western Blot等技术便可检测到LC3的表达[21]。Beclin-1作为酵母Atg6的同源物，与三类磷酸肌醇3-激酶(class III phosphoinositide 3-kinase，PI3K)和Atg14L等结合形成复合体，调控自噬前体和自噬体形成[22]。Beclin-1在大鼠脑内如皮质、海马、小脑等均有表达，免疫组化等方法在脑组织缺血后6 h即发现Beclin-1阳性细胞，24 h达高峰，至少持续48 h[23]。干扰Beclin-1表达可降低脑缺血诱导的自噬激活[24]。P62蛋白是一种支架蛋白，作为一种自噬特异性底物，偶联于LC3，通过自噬小体与溶酶体完成蛋白的降解[25]，在体内P62蛋白与自噬水平呈负相关，在大鼠局灶性脑缺血模型建立后6 h，该蛋白表达下调，持续至少48 h，在缺血后24 h达最低点。徐勤红等[26]通过随机对照的临床研究，观察“通督调神针法”与常规针刺治疗急性脑梗死患者的临床疗效差异及其与自噬的关系，结果发现“通督调神针法能明显提高急性脑梗死患者血清中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表达，促进自噬溶酶体形成，促使细胞自噬的大量启动，最终减轻CIRI，发挥神经保护作用，从而提高患者生活质量、智力水平及改善神经功能。冯晓东等[27]通过制备MCAO/R大鼠模型，观察电针神庭、百会穴对MCAO大鼠学习记忆能力、脑梗死体积以及Beclin-1表达的影响，结果发现电针神庭、百会穴可使MCAO/R大鼠逃离水迷宫的潜伏期明显缩短，可明显改善其学习记忆障碍，同时自噬相关基因Beclin-1与其蛋白表达均上调，提示电针对自噬水平的提高可能是其改善卒中后认知功能的机制之一。Ting Z等[28]通过血管闭塞建立脑缺血再灌注大鼠模型，电针百会、神门和足三里穴后，通过Western印迹法测量自噬相关蛋白LC3，mTOR和Beclin-1的表达情况以及TTC染色评估大鼠脑梗死面积，发现给予电针刺激后的大鼠的LC3和Beclin-1水平降低，mTOR水平升高。由此证明电针干预不仅可以减轻脑缺血引起的氧化和炎症损伤，同时可以通过抑制神经元的过度自噬改善CIRI。Shu S等[29]采用随机对照实验，给予脑缺血再灌注模型电针刺激，在不同时间下测量大鼠的神经功能缺损和脑梗死体积以评估改善效果，同时检测Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达以探讨电针对自噬的影响，结果显示电针可显著降低神经功能缺损评分和脑梗死体积，电针组中Beclin-1，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例显著降低，说明自噬可能是参与电针脑缺血再灌注损伤的关键机制之一。

3.2 从mTOR通路研究针刺对CIRI神经细胞自噬的影响

自噬的调节除了由多种分子参与外，还涉及了多条信号通路[30]，其中雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路是调节自噬的最主要信号通路。mTOR的上游涉及到PI3K/Akt、MAPK(ERK、JNK、p38MAPK)、AMPK(LKB1-AMPK)等多条信号通路。哺乳类动物体内唯一的mTOR是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，按功能可分为mTORC1和mTORC2，其中mTORC1主要调节自噬和蛋白质合成[31]。研究表明[32]，缺血缺氧刺激，通过ATP/AMP比值的降低来调控AMPK通路，抑制mTORC1活性进而诱导自噬。Carloni等[33]对SD大鼠缺血缺氧性脑损伤前侧脑室注射自噬诱导剂雷帕霉素、PI3K抑制剂渥曼青霉素、自噬抑制剂3-MA后，发现PI3K-Akt-mTOR自噬信号通路参与了缺血缺氧造成的损伤。Ⅲ型PI3K是细胞内一种能通过催化底物形成PI3P的关键酶，诱导自噬的产生，抑制细胞的凋亡和坏死，对细胞有保护作用。有研究者[34]通过给予缺血缺氧脑病大鼠的电针干预治疗，观察到电针对PI3K/Ak信号转导通路及下游靶蛋白mTOR具有调控作用，证实PI3K/Akt信号转导通路与缺血缺氧脑病的保护机制密切相关。何坚等[35]通过电针针刺MCAO/R模型大鼠曲池、足三里，并在电镜下观察发现，电针组mTORC1的表达比模型组提高，LC3-Ⅱ/LC3-I的比率却比模型组低，提示电针可抑制自噬溶酶体数量，说明电针可能通过mTORC1-ULK复合体-Beclin1通路抑制过度激活的细胞自噬，从而保护神经元。

3.3 从内质网应激途径研究针刺对CIRI神经细胞自噬的影响

内质网(Endoplasmic reticulum，ER)对膜蛋白的合成、初始翻译的修饰以及蛋白的正确折叠和分泌具有关键作用。脑缺血再灌注损伤后会破坏内质网功能，使得蛋白折叠受阻，大量未折叠或错误折叠蛋白蓄积于内，诱发内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)[36]，激活未折叠蛋白反应(Unfolded protein response, UPR)，增加伴侣分子的合成及错误折叠或未折叠蛋白质的降解来维持内质网的稳态平衡。当ERS激活时会进一步引发细胞自噬，以清除错误折叠蛋白，恢复内质网稳态；内质网内环境的平衡又反过来抑制ERS，减少细胞凋亡，促进细胞生存。由此，ERS与自噬的适度激活形成了机体内适应性、保护性的交互作用[37]。UPR是诱导细胞自噬的重要信号通路。UPR信号通路被激活后，内质网内的未折叠蛋白使得葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein78/Binding immuno-globulin protein，GRP78/Bip)释放PERK/elF2α、Ire1/TRAF2、ATF6α，共同调控下游CHOP，而CHOP转录调控抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，最终通过诱导自噬相关蛋白Beclin-1表达来影响自噬。舒适[38]在MCAO/R大鼠模型中，通过动态观察针刺水沟穴对CIRI后内质网应激UPR信号转导通路诱导自噬性程序性细胞死亡的影响，从内质网应激UPR三条信号转导通路PERK/el F2α、Ire1/TRAF2、ATF6α的分子作用途径深入阐释CIRI后自噬性程序性细胞死亡的作用机制以及针刺水沟穴减轻CIRI可能物质基础与有效作用靶点，结果发现电针水沟穴对大鼠CIRI的治疗作用机制可能与抑制Beclin-1、LC3表达，下调神经细胞自噬水平密切相关；电针水沟穴可能通过上调GRP78，干预UPR中PERK/e IF2α和IRE1通路，抑制CHOP表达水平来影响内质网应激；内质网应激CHOP通路调控Beclin-1表达，抑制过度自噬是针刺水沟穴减轻CIRI的重要环节；并由此推测针刺减轻发生CIRI可能与启动内质网应激UPR三条信号转导通路调控CHOP来诱导细胞自噬过程密切相关。

4 总结与展望

总之，细胞自噬是一把“双刃剑”，可广泛参与CIRI复杂的病理生理进程，影响细胞的存活与死亡。一方面适度自噬可帮助细胞恢复内环境的稳态，促进细胞自体修复，从而对神经细胞损伤发挥保护作用；另一方面过度自噬又可诱导自噬性细胞死亡、促进凋亡的发生与发展，从而加重神经细胞损伤，因此，探究CIRI后神经细胞自噬及其相关机制，具有重要的研究价值和科学研究意义。

针刺对CIRI后神经细胞自噬的研究刚刚起步，虽然我们已经对国内外文献进行了全面的检索，但有关此方面研究的文章总数还是相对较少，穴位选择、针灸干预措施等均缺乏重复测试，且多数为动物实验，仅有1篇临床研究。同时许多研究多针对CIRI后自噬相关蛋白展开研究，对自噬的通路、选择性自噬(内质网自噬、线粒体自噬、过氧化物酶体自噬)等研究相对较少。另外，采用的研究方法相对单一，多为透射电镜、Western Blot和RT-PCR等检测方法。实验设计上尚有很多不足，如缺乏特异性抑制剂、慢病毒干扰以及相关基因敲除等作为特异性对照；同时大多研究没有设立假针刺组和非穴位组等。相信随着针刺调控CIRI后细胞自噬严谨规范和更加细微深入的系统研究，针刺对CIRI后神经细胞的调控机制会更加明朗化，从而为缺血性脑卒中及脑缺血再灌注损伤的防治取得突破性的进展奠定坚实的基础。