五类内吸性杀菌剂在葡萄上的抗药性研究

周连柱，孔繁芳，张昊，王忠跃*

（中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

卵菌是一类重要的病原生物，包括霜霉、疫霉等重要病原菌，由卵菌引起的病害有霜霉病、疫病等，其危害作物种类多，流行速度快，造成的损失大。目前，生产上防治卵菌病害最普遍、最有效的方法还是化学防治。使用杀菌剂防治植物病害是保证农作物高产、稳产的重要措施之一。早在20世纪70年代以前，人们就开始用杀菌剂来防治病害，最初使用的杀菌剂类型为传统的保护性杀菌剂。保护性杀菌剂一般是在病原菌侵染植物前施药，保护植物免受病原菌的侵染为害，主要起表面保护作用，其作用位点多，药剂一般不进入植物体内，不易引发病菌对其产生抗药性。直到20世纪60年代末70年代初，大量的高效、内吸、选择性强的杀菌剂被相继开发和广泛应用。生产上防治卵菌病害常用的内吸性杀菌剂主要为甲氧基丙烯酸酯（QoI）类；羧酸酰胺类（CAAs）；苯基酰胺类（PAFs）；氰基乙酰胺类和磺胺咪唑类五大类[1-3]。随着内吸性杀菌剂的使用量增加、使用范围增大，病菌产生抗药性的现象频频被报道；抗药性产生导致的化学防治失效，使农业生产遭受巨大的损失[4-6]。因此，了解和掌握病原菌的抗性频率、抗性水平是抗药性治理、成功防控、化学农药科学使用的基础，也是我国“化学肥料和农药减施增效，农业绿色发展”战略的必然要求。

1 杀菌剂的抗性现状

1.1 苯基酰胺类杀菌剂

苯基酰胺类杀菌剂（Phenylamides，PAFs）主要包括甲霜灵、苯霜灵和恶霜灵。这三种药剂之间存在交互抗性，其中甲霜灵应用最为频繁和普遍，抗药性的研究与监测也最为深入透彻。甲霜灵最早于1970年被引入作为系统杀菌剂防治卵菌病害，被广泛用于防治致病疫霉和霜霉所引起的病害。1978年以色列用该药防治黄瓜霜霉病，一年后，经检测病菌对甲霜灵的抗药性水平高达500倍以上。1979年，荷兰和爱尔兰用甲霜灵防治马铃薯晚疫病，发现病原菌普遍对其产生抗药性，导致晚疫病大面积流行爆发。据Fourie等[7]报道，南非地区葡萄霜霉病对甲霜灵药剂的抗性频率已达94.2%。在国内，使用甲霜灵防治卵菌病害的许多地区病菌都产生了严重的抗药性[8-9]。Sun等[10]采用传统叶盘法检测了2007—2008年间我国7省11个地区葡萄霜霉病菌对甲霜灵的抗药性，结果显示，392菌株中有13%为敏感菌株，26%表现为低抗，61%为高抗，可见国内葡萄霜霉菌对甲霜灵已普遍产生抗药性。祝海娟等[11]采用叶盘漂浮法测定了国内8个省份13个黄瓜主产区的霜霉病菌对甲霜灵的抗药性，结果有91.7%表现高抗，8.3%表现中抗，无敏感和低抗菌株。

1.2 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（Strobilurins，QoIs）是一类能够有效控制子囊菌、担子菌、半知菌和卵菌为害的广谱性杀菌剂。其代表药剂为嘧菌酯，主要作用是抑制孢子萌发，游动孢子的释放和游动，对病害无治疗作用[12]。该类药剂于1996年进入市场用于防治小麦白粉病，两年后在德国北部3个地区首次发现了抗QoI类杀菌剂的抗性菌株，抗性倍数大于500，抗药性菌株在群体中的频率高达90%。1999年在法国和意大利相继检测到对QoI类杀菌剂具有抗性的葡萄霜霉菌株，随后欧洲在2000年检测到对嘧菌酯具有抗性的葡萄霜霉病菌[13]。同年，在德国的其它地区及法国、比利时、英国和丹麦也监测到抗药性个体[14]。张艳菊等[15]测定了我国8个省份13个黄瓜主产区霜霉菌对嘧菌酯的抗药性，结果显示无高抗菌株的存在，其中山东省菌株对嘧菌酯的抗性水平最高，其他省份抗性水平相对较低。王喜娜[16]2014年在河北永清县葡萄园中监测到抗性菌株的存在，这也是中国首次报道发现葡萄霜霉菌对嘧菌酯产生抗性。

1.3 羧酸酰胺类杀菌剂

羧酸酰胺类杀菌剂（Carboxylic acid amides，CAAs）是生产上用于替代苯基酰胺类杀菌剂，为缓解甲霜灵药剂的抗药性而研发的一类结构新颖的药剂。烯酰吗啉是该类药剂中最早研发成功的一种，20世纪80年代由美国氰氨公司研发并投入市场，对霜霉病和晚疫病有特效。烯酰吗啉于1988年投入市场，1994年，Albert等[17]就报道在法国地区出现了对该药剂敏感性降低的葡萄霜霉病菌群体；随后，在法国葡萄园中发现了抗烯酰吗啉的葡萄霜霉病菌株[18]。2005年，在法国的东西南部等多个地区相继监测到对烯酰吗啉敏感性下降的病菌，但抗药性频率都较低，并且抗性群体的比例随地区和年份的不同波动很大。对羧酸酰胺类杀菌剂的田间抗药性监测结果表明[19]，欧洲的主要葡萄产区葡萄霜霉病菌对烯酰吗啉仍然呈现中高等水平抗药性风险；意大利、德国、瑞士等国也均存在抗性群体，希腊和中国尚未检测到抗性群体。在中国，2010年Sun等[10]对采自全国7省11个地区采集的葡萄霜霉菌进行烯酰吗啉敏感性测定，未发现抗性菌株。至2014年，中国未见有关葡萄霜霉菌以及瓜果疫霉菌对烯酰吗啉产生抗药性的报道[20]。王喜娜等[21]报道在2015年广西资源县的葡萄霜霉病菌株中发现了对烯酰吗啉具有抗药性的菌株，这是国内首次关于葡萄霜霉病菌对烯酰吗啉具有抗性的报道。

1.4 氰基乙酰胺类杀菌剂

霜脲氰（Cymoxanil），是20世纪70年代末被研发并广泛应用于葡萄的一类系统防治卵菌病害的杀菌剂。在欧洲，使用霜脲氰防治葡萄霜霉病已有30多年的历史，大多数是采用和其他杀菌剂混合来防治该病害[22]。霜脲氰对霜霉病和晚疫病有特效，有相当长一段时间，霜脲氰被认为是一类具有低风险抗性的杀菌剂。然而，自20世纪90年代起，抗性菌株在意大利北部的两个葡萄园中被检测到。Sujkowski等[23]测定了来自墨西哥中部和北部的75个在遗传上具有多样性的致病疫霉菌株对霜脲氰的敏感性，结果表明各菌株对霜脲氰均表现敏感，且菌株间差异很小，EC50值在0.1～1.0 µg/mL。霜脲氰自20世纪90年代初开始在中国大量使用，大部分地区的用药历史在10年以上。王文桥等[24]报道，致病疫霉野生型菌株NS1经紫外线诱变及亚致死剂量的霜脲氰连续选择10代，均未产生对霜脲氰的抗性，认为疫霉菌对霜脲氰产生抗性的固有风险较小。罗赫荣等[25]用亚硝基胍诱变辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的游动孢子，筛选出29株抗甲霜灵、6株抗霜脲氰的突变菌株，并证明突变菌株的抗药性经无性和有性生殖均可稳定遗传。生产上，霜脲氰主要是同其他杀菌剂一起混合使用，很少单一使用，这在一定程度上降低了病原菌对其产生抗药性的机率。2015年，Toffolatti等[26]通过卵孢子萌发试验对意大利的葡萄霜霉菌对霜脲氰杀菌剂的敏感性进行了测定，结果表明，病菌对该药剂的EC50值低于10µg/mL，采集的样品中抗性菌株仅为16%，且只有3株菌株表现为高抗，并且在停止使用霜脲氰药剂后菌株能恢复其敏感性。国内对霜脲氰的抗药性研究相对较少，但杀菌剂防效频频下降的现象使得抗药性研究迫在眉睫。

1.5 磺胺咪唑类杀菌剂

磺胺咪唑类杀菌剂代表药剂为氰霜唑，作为对卵菌纲病害有特效的一款药剂，氰霜唑对霜霉病、疫病有良好的效果。并且与市场上的苯酰胺类、羧酸酰胺类杀菌剂无交互抗性。目前市场上使用的多为其复配产品，多与烯酰吗啉、嘧菌酯等药剂制成混剂使用。国内外对氰霜唑抗药性的研究相对较少，2008年Kousik等[27]首次报道美国东南部疫霉抗性菌株的存在，通过试验发现菌株EC50值为3.8～535µg/mL，部分菌株高达1000µg/mL。2012年，Jackson等[28]通过对美国乔治亚州辣椒疫霉对氰霜唑、双炔酰菌胺和烯酰吗啉三种药剂的混剂的抗药性进行检测，在三种药剂单独使用的情况下，通过菌丝生长、孢子萌发等方法检测菌株抗药性，结果发现菌株对双炔酰菌胺和烯酰吗啉均较敏感，而对氰霜唑已产生一定程度的抗药性，菌丝生长法和孢子萌发法测定结果显示其最小抑制浓度（MIC）已达500 µg/mL，但混合物对孢子的萌发有很高的抑制作用，其平均EC50值仅为 0.04µg/mL，可见氰霜唑单独使用抗药性风险较高。

2 抗性类型和抗性机制

2.1 苯基酰胺类杀菌剂

苯基酰胺类杀菌剂（Phenylamides，PAFs）的主要作用方式是抑制蛋白质及RNA的生物合成，特异性地抑制核糖体RNA聚合酶Ⅰ的活性，对植物病害的各主要生长阶段如菌丝生长、吸器形成及孢子囊产生均具有很好的抑制作用。甲霜灵（Metalaxyl）为这类杀菌剂的代表。

对苯基酰胺类杀菌剂的抗药性研究已有一定的历史，大量的研究表明，卵菌对甲霜灵的抗药性是由单个主效基因控制的质量遗传性状，但病菌基因组中的抗性相关基因和抗性突变位点目前还尚不明确。2014年Randall等[29]报道，甲霜灵的抗性与编码RNA聚合酶Ⅰ大亚基RPA190基因单核苷酸多态性SNP T1145A位点的突变相关，T和A分别代表敏感和抗性两种类型，当该位点的碱基T突变为A时会造成络氨酸被苯丙氨酸替代，最终导致RPA190等位基因由抗药型变为敏感型。同年后续的试验表明，只有少数的抗性菌株在1145位点存在单核苷酸多态性变化，这与1999年Judelson等[30]报道中甲霜灵的抗药性不是由单一位点控制的结果相一致。2015年Michael[31]通过DNA测序、SNP和高分辨率溶解曲线（HRM）试验证明，RPA190等位基因的SNP T1145A位点的变化与甲霜灵抗药性的变化不一致，指出用RPA190基因的变化不能够充分诊断田间菌株对甲霜灵的敏感性水平。刘洪斌等[32]通过试验发现对甲霜灵抗性和敏感的马铃薯晚疫病菌杂交后F1代主要为中抗类型，两个中抗F1代杂交后代F2中的抗、中抗、敏感菌株的比例为1∶2∶1，表明病原菌对苯基酰胺类杀菌剂的抗药性是由单个主效基因控制。

2.2 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（Strobilurins，QoIs）代表药剂嘧菌酯是一种高选择性单一位点抑制剂，其通过与线粒体呼吸链中细胞色素b、c1复合物中的Qo位点结合，从而达到阻碍电子传递、影响线粒体的呼吸作用的目的。大量的试验表明，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的抗药性属于质量遗传抗药性，在大多数病原菌中，细胞色素b基因中存在两种主要的突变导致产生抗药性，分别为143位甘氨酸被丙氨酸替代和129位苯丙氨酸被亮氨酸替代（G143A、F129L），143位甘氨酸被丙氨酸替代这种情况最为普遍[33]。在对细胞色素b基因143位氨基酸突变的研究中发现，从遗传学角度看存在4种主要的单倍型差异，这表明葡萄霜霉菌群体抗性至少存在两种不同的起源。在法国霜霉菌抗药性检测中单倍型I（IS、IR）和单倍型II（IIS、IIR）的抗性频率分别达到了75%和25%，并且这种分布差异很大[34]。

2.3 羧酸酰胺类杀菌剂

羧酸酰胺类杀菌剂（Carboxylic acid amides，CAAs）能够抑制病原菌的菌丝生长、孢子囊及休止孢的萌发、卵孢子或孢子囊的形成，但是对游动孢子的游动、释放以及休止孢的形成无抑制作用[35]。烯酰吗啉为该类杀菌剂的代表，其作用机制是破坏病菌细胞壁膜的形成，引起孢子囊壁的分解，而使病菌死亡。

生物学试验研究表明，病原菌对烯酰吗啉的抗药性主要与纤维素合酶基因1105位点碱基突变有关。大量的试验表明，病菌自然状态下纤维素合酶PcCesA3基因在1105位的密码子为GGC，编码甘氨酸（GLy），在接触大量的烯酰吗啉药剂后，该位点已发生碱基突变，由原来的GGC突变为AGC编码丝氨酸（Ser）或者突变为GTC编码缬氨酸（Val）[36-37]。并且发现在所有对烯酰吗啉敏感的菌株中，在1105位点编码的氨基酸为GLy/GLy、GLy/Val、GLy/Ser，而在抗烯酰吗啉的菌株中，在病菌的纤维素合酶PcCesA3基因的1105位点编码的氨基酸为Ser/Ser、Val/Val、Ser/Val，即只有病菌在该位点发生纯合突变，病菌才会由原来的对烯酰吗啉敏感转变为抗性，杂合突变只是抗性携带者并不表现为抗性[38-39]。

2.4 氰基乙酰胺类杀菌剂

霜脲氰（Cymoxanil）对病菌的各个生命活动进程均有影响，孢子囊萌发以及游动孢子释放游动等一系列生物学试验证明，霜脲氰在核酸和氨基酸的生物合成等一些二级反应过程发挥重要作用。另一方面霜脲氰对DNA合成过程的影响明显大于RNA合成的影响，但主要的作用位点、作用机制目前仍是未解之谜[40]。

2.5 磺胺咪唑类杀菌剂

氰霜唑（Cyazofamid）是一种保护性杀菌剂，通过结合细胞色素b、cl复合体中的Qi位点阻断卵菌线粒体细胞色素b、cl络合物中的电子传递来干扰能量供应。它的作用部位是在酶的Qi中心，这种作用机制不同于其他传统杀菌剂，包括甲氧基丙烯酸酯类。氰霜唑通过干扰能量供应可以阻碍游动孢子萌发、游动至孢子囊形成的各个生育阶段，从而达到预防和控制病害蔓延的目的[41]。对霜霉病、晚疫病和十字花科根肿病有特效。通过在试验中额外添加ATP，降低氰霜唑的药效，表明氰霜唑的作用方式与ATP能量供应系统紧密相连[42]。2014年，Li等[43]开展了抗霉素和氰霜唑两种Qi位点抑制剂的抑制动力学对比试验，结果表明，抗霉素属于疏松性位点结合抑制剂，而氰霜唑则是紧密型位点结合抑制剂，其与Qi位点结合紧密，是一种典型的Qi位点抑制剂。

3 抗药性检测方法

3.1 传统检测方法

葡萄霜霉病对杀菌剂的抗药性检测方法通常采用传统叶盘漂浮法[7]，以鲜嫩易感病的葡萄叶片作为试验材料，一般为‘里扎马特’‘赤霞珠’‘玫瑰香’等易感品种，先用1%的次氯酸钠溶液进行消毒，30 s后用去离子水清洗，然后在超净工作台中用打孔器打成15 mm叶盘，试验过程中将叶盘漂浮在装有药液的9 cm培养皿中，每皿10个叶盘，对照组采用无菌水代替药液，根据发病情况判断抗药性情况。

甲霜灵（Metalaxyl）目前主要采用此方法进行抗药性检测，其普遍使用敏感检测浓度MIC（0.1 μg/mL）作为敏感参考标准用于判断其他试验的敏感性情况[44]，根据Stahle-Csech的抗性因子检测标准[45]，RF＞100即表示产生了抗性，定义当MIC＝1 μg/mL、RF＝10时为敏感菌株；当MIC＝10 μg/mL、RF＝100时为低抗；当MIC＝100 μg/mL、RF＝1000时为抗性；当MIC ≥200 μg/mL、RF≥200时为高抗。在葡萄霜霉菌对甲霜灵的抗药性试验中，采用MIC为10 μg/mL和100 μg/mL两个明显的检测浓度标准[7]，即菌株在空白对照组中发病且在10 μg/mL药液浓度下未发病，定义为敏感菌株；在10 μg/mL药液浓度下发病，但在100 μg/mL药剂浓度下未发病的菌株定义为低抗菌株；在100 μg/mL药剂浓度下发病的菌株定义为高抗。这套检测体系一直作为检测甲霜灵抗药性的标准体系沿用至今。

嘧菌酯（Azoxystrobin）抗药性检测目前有两种主要的方法，传统叶盘漂浮法和分子检测技术，在传统检测方法中，根据Wong等[46]的报道，葡萄霜霉菌对嘧菌酯药剂的EC50值范围为0.04～0.94 μg/mL，均值0.40 μg/mL。传统叶盘法进行霜霉菌对嘧菌酯抗性检测所用的鉴别浓度为1000 μg/mL[47]，定义菌株在1000 μg/mL药液浓度下发病即产生了抗药性。

烯酰吗啉（Dimethomorph），目前有两种主要的抗药性检测方法，传统叶盘漂浮法和分子检测技术。据Sun等[10]的报道，葡萄霜霉菌对烯酰吗啉的EC50值范围为0.01～0.21 μg/mL，均值为0.11 μg/mL，传统叶盘法进行葡萄霜霉菌对烯酰吗啉抗性检测标准浓度为1.6 μg/mL，当MIC＞1.6 μg/mL即为抗性个体，当MIC＜1.6 μg/mL为敏感个体。

霜脲氰（Cymoxanil），目前没有明确统一的检测标准，其作用的方式也尚未知晓，研究中一般主要采用传统的叶盘漂浮法进行抗药性初步判定。在已报道的文献中将参考菌株的MIC值3 μg/mL作为标准参考基线，以此为标准测定试验菌株的抗性因子，抗性因子RF≥10即表示产生了抗性；田间用药的标准参考基线为120 μg/mL，可用此标准进行田间或者栽培植株整体抗药性试验[48]。

氰霜唑（Cyzaofamid）一般作为混剂使用，国内外研究报道都较少，抗药性检测所使用的方法也只有传统的检测方法。2001年，有研究报道通过菌丝生长法测定疫霉菌对氰霜唑的EC50值为0.008～0.2 μg/mL，对游动孢子释放的MIC为0.1 μg/mL[41]。2012年研究报道氰霜唑对辣椒炭疽病菌的菌丝生长MIC值达到500 μg/mL，但游动孢子囊萌发试验显示其EC50值为0.007～0.008 μg/mL[28]。关于葡萄霜霉病对氰霜唑的抗药性相关研究还较少，其抗药性检测标准，MIC以及EC50值等目前尚未明确，有待进一步探索。

这些传统的检测方法存在周期长、效率低、工作量大且稳定性差等缺点。由于葡萄霜霉菌为专性寄生菌，培养条件较为严苛且培养周期较长，因此采用传统方法检测其抗药性不仅耗费时间而且其结果受培养条件和药剂的质量影响较大。随着杀菌剂的作用方式和抗性机理不断被揭示，根据杀菌剂的抗性机制，越来越多的分子检测技术被相继开发应用，传统的检测方法也逐渐被现代的分子检测技术替代。

3.2 分子检测技术

随着现代分子生物学技术的不断发展，杀菌剂的作用机理以及病原菌的抗性机制相继被揭示，核酸水平的分子检测技术已成功应用于已明确抗药性突变位点的病原菌田间早期的抗性菌株的快速、准确检测以及监测抗药性群体的发展动态等。应用此方法的一个重要前提是杀菌剂的机制以及病原菌的抗药性突变位点必须明确清晰，因此，目前该技术还处于初步发展阶段，许多杀菌剂的机理以及对应的病原菌抗药性突变机制还尚不清晰。

随着部分杀菌剂的抗性机制的明确，分子检测技术被广泛应用于抗性频率的检测。目前，用于检测杀菌剂抗性的分子技术层出不穷，如突变阻滞扩增系统（ARMS）、PCR-RFLP和nested PCR-RFLP技术、高分辨率溶解曲线（HRM）、环介导恒温扩增法（LAMP）、Tetra-primers ARMS PCR以及Taqman-MGB探针实时荧光PCR检测技术等[49-51]。Aoki等[52-53]根据葡萄霜霉菌对羧酸酰胺类杀菌剂产生抗性后的单核苷酸点突变这一原理，开发了PCR-RFLP抗药性分子检测技术，显著提高了检测效率。Zhang等[54]基于葡萄霜霉菌对烯酰吗啉抗性突变位点，建立了Tetra-primers ARMS PCR检测方法。Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测技术是一项灵敏度高、特异性强的分子检测技术，MGB分子的存在使得Taqman探针与互补的DNA 链结合更为特异。因此，探针可以识别出DNA链中的单个碱基变化[55]。郭庆[56]利用Taqman-MGB探针实时荧光PCR检测技术对葡萄根瘤蚜进行检测，证明了该方法的特异性，灵敏度可达1.625拷贝/μL。金丽兰等[57]利用该技术分析了YP3A5基因rs776746位点单核苷酸多态性，结果发现该技术对于CYP3A5 rs776746位点基因型的区分效率极高，最低检测含量仅为0.01 ng，具有较好的特异性和灵敏度。这些方法各有优势与缺点，因根据自身研究的目的合理选择相应的方法。

4 展望

目前，生产上用于防治卵菌的五大类主要内吸性杀菌剂中，只有羧酸酰胺类杀菌剂中的烯酰吗啉和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂中的嘧菌酯的病原菌抗性机制和抗药性突变位点已经明确[58-59]。常用的检测这两种药剂抗药性的方法主要为 PCR-RFLP和Nested PCR-RFLP技术、Tetra-primers ARMS PCR以及Taqman-MGB探针实时荧光PCR检测技术。对于甲霜灵、霜脲氰和氰霜唑这3种药剂其病原菌抗性机制还在研究探索中。目前，代谢组学相关技术已经应用于甲霜灵抗药性的检测，通过测定甲霜灵用药前后病原菌体内各组分的代谢变化来辨别抗性菌株和敏感菌株。Pomerantz等[60-61]报道，使用红外光谱图探测技术测定了疫霉菌在使用甲霜灵前后的主要物质变化，用于判定菌株是否对药剂产生抗药性。随着科技的快速发展，各药剂的作用机制、抗性突变机制以及病原菌抗药性问题都将一一被解决。