指纹图谱技术在葡萄及葡萄酒研究上的应用

张晶莹，魏彦锋*，梁红敏，崔玲玲

（山东省葡萄研究院，山东济南 250100）

葡萄是葡萄科（Vitaceae）葡萄属（VitisL.）落叶藤本植物，在世界范围内广泛种植，品种丰富，具有极高的经济价值。截止到2016年，我国葡萄栽培面积达84.7万 hm2，产量1374.5万 t[1-2]，入圃保存的葡萄种质资源超过3000份[3]。葡萄种质资源丰富，易芽变，易扦插繁殖，且不同地区之间品种交流频繁，造成同名异物或同物异名现象严重，给葡萄的选育和推广带来很多不便。葡萄酒作为葡萄最主要的加工产品，其质量与原料种植的生态环境、品种、采收酿造年份等有着密切的关系，随着葡萄酒市场的扩大，一些低劣、假冒葡萄酒产品给消费者带来很多困扰和损害。目前，鉴定和评价葡萄及葡萄酒品质的方法主要是通过测定主要化学成分，或理化指标、感官审评等，具有一定的局限性，缺乏客观的科学量化依据。

指纹图谱技术，是在现代分析技术的基础上，发展起来的从整体上研究复杂物质体系的一大类技术的统称。以图谱的形式呈现，强调对植物研究对象“共有特征性”的研究，并在共有特性中寻找个性差异。目前在中药或天然药物质量控制领域应用最为成熟，是国际公认的最有效手段。指纹图谱技术首先将样品经适当前处理，再采用一定的分析手段，得到能够标示其某一特征的图谱，最后将谱学分析法与计量学处理方法相结合，建立葡萄指纹图谱能有效解决葡萄品种鉴定、产地识别、种属相关等问题，建立葡萄酒指纹图谱能准确区分和鉴别酿造品种、酒龄和产地。笔者就近年来指纹图谱技术在葡萄及葡萄酒方面的应用研究进行综述。

1 指纹图谱技术的分类

随着指纹图谱的应用范围不断扩大及新技术的产生，其分类也在不断延伸、细化。目前，根据不同的分析手段和特征性成分，可将指纹图谱分为生物指纹图谱和化学指纹图谱两大类：生物指纹图谱包括蛋白质指纹图谱、DNA指纹图谱等；化学指纹图谱包括光谱指纹图谱、色谱指纹图谱等。

1.1 生物指纹图谱

生物指纹图谱是由多态性丰富的电泳图谱组成的，具有高度的特异性和稳定性，能够鉴别生物个体或群体之间的差异。根据电泳分离的物质不同，可分为蛋白质指纹图谱和DNA指纹图谱，后者在葡萄种质资源研究领域应用较多。蛋白质指纹图谱，或叫蛋白电泳指纹图谱，主要是以聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（SDS-PAGE）来完成的，在国内外广泛用于水稻、玉米、小麦、大麦、豌豆等作物的品种鉴定与分类中，在烟草种子、川白芷种子、贝母等植物相关研究中也有探索。葡萄蛋白质主要集中在葡萄籽中，而葡萄籽约占葡萄重量的5%左右[4]，经过脱脂脱酚工序后的葡萄籽粕中的粗蛋白含量仅为11%～13%[5]，蛋白质含量低且不易提取纯化是蛋白质指纹图谱技术在葡萄研究领域应用较少的原因，所以本文不再讨论。

DNA指纹图谱是目前最具吸引力的生物鉴定技术。生物体内存在一些高变异性的DNA序列，它们能在本类群或个体中稳定遗传，从而在生物体内表现出稳定的、可遗传的差异。DNA指纹图谱技术就是利用这些DNA序列，通过不同的分子标记技术来构建的。首先利用共同的引物，对多个对象进行检测，然后寻找出检测对象中变异性相对较大的特定DNA片段，最后扩增，以电泳图谱的形式展现，即作为该检测对象的特征性DNA指纹图谱。常用的分子标记技术有：简单重复序列或微卫星标记（SSR）、内部简单重复序列（ISSR）、扩增片段长度多态性（AFLP）、单核苷酸多态性（SNPs）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、单核苷酸多态性（SNP）、相关序列扩增多态性（SRAP）等[6]。

1.2 化学指纹图谱

化学指纹图谱是建立在化学成分系统研究的基础上，运用色谱、光谱等现代分析技术，以图形、图像和数据的方式对物质的特性和有效成分进行表征，并加以描述，从而全面反映植物对象所含化学成分的种类与数量，进而达到识别真伪、辨认优劣和质量判定等目的。

光谱技术主要有紫外光谱、红外光谱、荧光光谱、核磁共振光谱等，目前广泛应用于中药、食品、香精香料等行业的质量控制和品质鉴定中。光谱技术应用在葡萄酒主要成分的定性分析较多，定量分析也大都只针对某一指标如酒精度、pH、糖类、酸类等。李霞[7]用近红外光谱结合PLS法，以95个‘赤霞珠’干红葡萄酒样品为研究对象，建立了5个品质指标定量模型，创新了组合预处理方法。但研究发现，近红外光谱技术不适用单体花色苷成分的检测，而花色苷是红葡萄酒中最重要的特性成分，所以光谱指纹图谱不适于在葡萄酒领域应用推广，所以本文不再单独讨论，有以色谱技术为主光谱技术为辅的指纹图谱方法在下文中出现。

色谱指纹图谱技术在葡萄酒研究领域应用较多，应用的色谱技术以高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）为主，还有仪器联用技术如气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）等。

2 DNA指纹图谱技术在葡萄研究上的应用

葡萄栽培主要是利用其无性繁殖的特性，易于品种传播和品质保持。但由于葡萄属种间杂交容易，使得一个品种可能有来自多个类群的血统，即会产生一些中间型或过渡型杂交；加上自然杂交、栽培环境不同以及自身变异等，这些因素都导致了葡萄品种混淆、不易分辨的普遍现象。

传统的种质鉴定方法以形态学为主，如对表型性状“嫩梢梢尖形态”“幼叶表面颜色”“上表面光泽”等的描述，这种方法易受环境条件和主观因素的影响。而且随着育种工作中骨干亲本的集中使用，葡萄品种间的遗传差异越来越小，因此仅凭对表型性状的差异描述很难做到准确鉴定和分类。基于DNA分子标记技术的指纹图谱方法可以大大提高种质鉴定的准确度，减少工作量，它具有多态性高、数量丰富、遗传稳定、多为共显性、遍及整个基因组等优点，为保护葡萄种质资源和全面系统命名提供了有效的技术支持。近几年，许多学者尝试利用RAPD、SSR、SRAP、ISSR、AFLP等分子标记技术从DNA水平上对葡萄属植物进行品种间的遗传多样性、亲缘关系和品种鉴定等方面的研究。

2.1 亲缘关系分析

葡萄植株样本亲缘关系越近，分子标记的多态性差异越小，反之亦然。DNA指纹图谱技术就是利用了这一性质，有效识别品种的亲本和后代，进而重新构建品种的亲缘关系系谱，为遗传改良提供依据。姚玉新等[8]为明确酿酒葡萄品种‘蛇龙珠’的身份，先用RAPD将14个酿酒品种划分为4个类群，再用SSR对‘蛇龙珠’所在类群进一步分析，证实了‘蛇龙珠’是一个独立的品种，和‘品丽珠’‘美乐’‘赤霞珠’有较近的亲缘关系。Laucou等[9]利用20对SSR引物对葡萄砧木品种‘弗卡（Fercal）’进行分析，确定其母本为‘B.C. n°1B’、父本为‘31 Richter’，排除了传统记载中错误的父本来源‘333 Ecolede Montpellier’，为‘弗卡’的系谱重建提供了理论依据。史圆圆等[10]采用SRAP分子标记技术结合聚类分析，对23个国内外主流的无核葡萄品种的种质亲缘关系进行分析，结果显示23个品种被分为4个类群，其中欧亚品种间亲缘关系较近，欧美杂种具有较高的遗传多样性，杂交育种时应注意亲本选择。郭春苗等[11]对新疆44个相对适宜制干葡萄品种（系）进行了基于SSR标记遗传多样性分析，按照亲缘关系的远近聚为五大类，并利用4条引物构建了品种DNA指纹图谱，提示同一引物在不同品种间出现相同谱带的现象不可避免，试验中视情况增加引物组合数量、结合形态学数据完善图谱是十分必要的。尹玲等[12]收集了国内新育成的24个鲜食葡萄品种，采用6对国际通用的SSR荧光标记引物进行扩增，通过毛细管电泳进行基因分型，证明了SSR标记可用于品种鉴定、区分种属以及判定倍性，最终建立了外加10个对照组总共34个品种的指纹图谱，可用于品种间亲缘关系的鉴定。

2.2 品种鉴定

通过分子标记绘制的指纹图谱具有个体特异性，不受环境、发育阶段的影响，能准确、快速而省时地鉴定品种或品系，为作物育种和种质管理提供了极大的便利。张永辉等[13]对来源于国家果树种质郑州葡萄资源圃的16个中国野生种葡萄及65个近缘植物的供试材料进行分类研究，ISSR聚类结果显示‘毛葡萄1099’真实身份应属于桑叶葡萄，怀疑‘燕山葡萄0947’是一个种间杂种，混进了美洲葡萄的血缘。金炳奎等[14]以东北长白山区的葡萄品种为材料，对SRAP分子标记技术体系进行优化，结果表明每个品种都能找出其特有条带，6个山葡萄品种最少可用2对引物来鉴别。Daniela[15]利用RAPD标记对来自两个种植区的10个鲜食葡萄品种的遗传多样性和亲缘关系进行分析，并构建了系统分析树；鲍露等[16]针对葡萄叶片富含多糖和多酚类等杂质影响DNA的提取纯化问题，对AFLP流程进行优化改进并建立体系，成功区分了‘超藤’和‘藤稔’这两个亲缘关系十分接近的品种。温景辉等[17]利用SSR标记技术将20份葡萄材料分为4大类群，进一步将山葡萄与欧亚种、美洲杂种很好的分开。杨航宇等[18]利用SSR标记技术对43份葡萄品种构建DNA指纹图谱，并与VIVC标准数据库进行比对，可将酿酒品种和鲜食品种、欧亚种和欧美杂种很好的区分。

2.3 分子身份证及数据库管理系统的建立

近几年，植物“分子身份证”的相关研究十分火热，2014年北京市农林科学院玉米研究中心，通过20多年的努力，为18 000多个玉米品种建立了分子身份证，建成世界最大的玉米DNA指纹库，囊括了我国全部玉米品种，还有大量国外玉米品种及组合。“分子身份证”是在DNA指纹图谱基础上提出的概念，即每个种质都拥有一个属于自己的字符串形式的代码，赋予种质本身作为识别品种的一个标准。杜晶晶等[19]以保存在国家葡萄品种资源圃内的80份葡萄种质为试材，利用SSR标记技术，证明了该法可有效用于建立葡萄种质资源分子身份证。Emanuelli等[20]利用SSR和SNP标记技术，并结合基因型和表型信息的对比，对欧洲葡萄种质进行遗传多样性和种群结构评价，深入分析了欧洲种质内部的遗传特性。王慧玲等[21]以北京市农林科学院13个葡萄新品种为试材，利用SSR标记技术建立指纹图谱，并赋值编码构建分子身份证，为新品种保护提供一定的参考。董志刚等[22]利用SSR标记技术对15份酿酒葡萄进行亲缘关系分析，以及种质识别和分类，通过多态性谱带有序编码转换，构建其分子身份证系统，也证明了方法的可行性。

由此可以看出，葡萄“分子身份证”的构建才刚刚起步，构建的过程也促使DNA指纹图谱技术的应用更加规范、准确和深入。比如可利用尽量少且是国际通用的引物来区分大量的品种、降低数据的冗余程度等。在所得到的图谱后加上涵盖品种详细信息，即将“分子身份证”与形态学描述相结合，就可建立更加完善的葡萄品种分子数据库。李贝贝等[23]对314个葡萄品种进行了DNA指纹数据库的初步构建，并将其中61份中国葡萄品种的基因型数据，与欧洲葡萄品种分子数据库（www.vivc.de）中的数据进行了对比，但该数据库是以Excel表格形式呈现出来的，不利于共享。所以要建立更加完善的葡萄品种数据库，还需对数据分析、图谱识别、系统整合等方向做深入研究。

3 色谱指纹图谱技术在葡萄酒研究上的应用

一款高品质葡萄酒几乎都会冠上“产地酒”“品种酒”和“年份酒”的标签，彰显着较高的商业价值，但其真实性很难快速查证。目前，我国现行的葡萄酒质量标准只对理化指标、卫生指标有严格的要求。在国际上，除了理化及卫生指标外，也只加重了感官鉴定的比重。所以对于葡萄酒的酿造品种、产地甚至年份的考察几乎没有科学准确的方法，这也让不法厂家有了各种形式的造假可能。

应用色谱指纹图谱技术可以全面且直观地反映葡萄酒中的化学成分种类与数量，利用酒中特征性成分，对葡萄酒的真实属性及品质进行有效评价。指纹图谱技术不需要测定葡萄酒的各种化学成分，即不需要对单一成分进行定量，避免使用昂贵的标准样品，只需对酒中特征性化学成分的含量或组成利用色谱分析方法展现出来，从宏观上分析被测酒样之间的差异，为葡萄酒质量控制提供科学有效的方法。常用的色谱方法有高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC），还有些仪器联用方法如气相-质谱联用（GC-MS）、高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）等。

HPLC主要是以葡萄酒中不易挥发的特征性组分如多酚类物质为检测对象再结合模式识别方法来建立图谱。样品前处理简单，不需要定性每个成分，只需要确保一致性，能满足以指纹图谱方法来控制葡萄酒质量、辨别真伪的主要目的，所以HPLC具有相当的优势[24]。GC则适用于具有挥发性成分的葡萄酒香气的指纹图谱研究，它具有样品用量少、选择性强、分离速度快且效能高等优点。挥发性成分也是鉴定葡萄酒品种的重要依据，不同品种酿造的葡萄酒，香气组分会有显著差异，甚至存在特有的典型香气。仪器联用方法如GC-MS、HPLC-MS不仅利用了色谱的高分离效能，还兼备了质谱鉴定的准确性和高灵敏性，能够提供指纹图谱中主要成分的化学结构信息，还能克服因色谱峰重叠而造成的定性、定量不准确的问题，已成为化学指纹图谱技术研究的重要手段。

3.1 葡萄酒品种的鉴定

酿造品种是决定葡萄酒质量的根本因素，但采用DNA鉴定方法没有意义，因为从葡萄酒中提取DNA几乎是不可能的。葡萄酒酿造品种由于其遗传特性，在化学成分上表现出较大的差异，例如不同葡萄品种的多酚物质含量构成会有一定的差异，所以多酚物质的含量和比例能直接反应红葡萄酒品种[25]。国内外对葡萄及葡萄酒中的花色苷（花色素）、单体酚等多酚类物质进行了大量的研究和鉴定，但从整体性上对葡萄酒多酚指纹图谱的研究、对不同品种葡萄酒进行识别的相关研究才刚刚起步。

Revilla等[26]利用HPLC分析发现，‘赤霞珠’‘美乐’‘门西亚（Mencía）’‘加尔纳恰（Carnacha）’葡萄品种的花色苷图谱存在明显的不同，‘加尔纳恰’葡萄酒的锦葵色素葡萄糖苷相对含量达到64.69%，显著高于其他品种葡萄酒，‘赤霞珠’的锦葵色素乙酰葡萄糖苷相对含量达到30.35%，显著高于其他品种。张军翔等[27]利用HPLC建立了9个不同品种葡萄酒的花色苷指纹图谱，数据显示出各品种葡萄酒之间花色苷种类和含量存在差别，山葡萄种及杂种葡萄酒的特征色谱峰中，有一些明显与欧亚种不同，由此可作为判别标准。郭艳波[28]以2～3个年份的南方野生山葡萄酒为研究对象，葡萄来源分别为福建省溪塔沟产刺葡萄品种和广西引种的‘桂葡一号’毛葡萄，构建了南方野生葡萄酒中单体酚HPLC指纹图谱，很好的区分了两个品种的山葡萄酒。

3.2 酒龄和产地的区分

酒龄是红葡萄酒重要的商业指标之一，消费者普遍认为酒龄越大其葡萄酒的质量越好、价格越贵。近些年，各式各样的葡萄酒品鉴培训活动广受欢迎，虽然感官品尝可以鉴定葡萄酒酒龄，但需要高超的品鉴技艺和丰富的品酒经验，主观影响因素很大。因此，急需客观科学的葡萄酒酒龄鉴定方法，为质量监督部门和消费者提供方法依据。

较年轻的红葡萄酒中存在大量的游离花青素，使葡萄酒体呈紫红色，随着陈酿时间的延长，尤其是陈酿1年后，游离花青素迅速减少[29]，聚合形成更加稳定的色素形态如单宁，酒体会由亮紫色转向砖红色，而老龄葡萄酒苦涩味减轻、砖红色褪去。所以利用葡萄酒陈酿过程中花青素和聚合色素的变化规律，采用HPLC指纹图谱方法，可分析鉴定红葡萄酒酒龄。张军翔等[30]研究发现，6个不同酒龄的‘蛇龙珠’葡萄酒的HPLC花青素指纹图谱明显不同。李彪[31]结合GC-MS和IR技术对不同品牌、但同酒精度同香型的白酒进行研究，所建指纹图谱可以区分不同年份的白酒，该研究中建立的方法和识别用的模型可以为鉴定葡萄酒的酒龄提供参考。

国内外葡萄酒长期生产实践及研究表明，酒体中的酚类物质、香气物质的含量和比例与生产地域密切相关，也就是说，来自不同地域的同一品种葡萄酒，其特性明显不同[32]。王秀芹等[33]发现5个不同产地的‘赤霞珠’葡萄酒中，酚酸、黄烷-3-醇和黄酮醇这3种酚类物质的含量存在明显差异。韩国民[34]在确定了葡萄酒中14种单体酚的HPLC测定方法的基础上，分别建立了来自四川九寨沟和云南香格里拉的‘赤霞珠’干红葡萄酒的HPLC指纹图谱。谢建军等[35]研究南非、法国、澳大利亚、智利等10个常见葡萄酒产地的85份红葡萄酒样品GC指纹图谱，结果表明不同国家的红葡萄酒GC指纹图谱存在差异，其色谱峰的相对峰面积和数量不同，即各有特征峰，证明该法可以用来甄别假冒产地葡萄酒。张宪臣[36]等通过使用GC-MS建立了进口‘霞多丽’干白葡萄酒香气物质特征指纹图谱，使用HPLC-DAD-MS建立了进口‘霞多丽’干白葡萄酒酚类化合物特征指纹图谱，进而建立了利用双指纹图谱溯源产地的方法。

3.3 真伪葡萄酒鉴定

目前国内市场上一般存在3种情况的掺假葡萄酒：第一，掺水。目的是降低葡萄酒的生产成本；第二，添加商标上未说明的化学物质，如色素。目的是增强葡萄酒颜色，提高外观品质；第三，进行商标上未说明的勾兑，如使用非欧洲种勾兑欧洲种葡萄酒。目的是降低生产成本，提高感官品质。劣质葡萄酒轻者是假冒品种、酒龄和产地，夸大产品价值；重者直接通过各种造假手段进行伪造。而现行的葡萄酒质量标准中，只是对酒中常量或微量理化成分、微生物和重金属含量进行了限定，如何利用化学或物理方法对葡萄酒的品质进行更加准确的评定是当前学术领域研究的热点。

莫寅斌[37]通过试验研究建立了葡萄酒HPLC花色素指纹图谱及识别模式，对贺兰山东麓的不同品种红葡萄酒进行了区分，还对市售葡萄酒进行鉴别，成功鉴定出一款掺水和另一款添加了黑米色素的掺假葡萄酒。谢建军等[38]通过对10个主要葡萄酒生产国所产的85份红葡萄酒进行GC分析，提取红葡萄酒12个典型的共有峰，构建了红葡萄酒GC标准指纹图谱，能够对市场上常见的3种所谓“三精一水”勾兑的假葡萄酒成功鉴别。

4 总结与展望

在葡萄种质资源研究领域，应用基于DNA分子标记技术的指纹图谱技术，可以从DNA水平上对葡萄属植物进行品种间的遗传多样性、亲缘关系和品种鉴定等方面的研究，进而建立葡萄分子身份证及数据库管理系统。要建立一个完善的数据库系统，需要整合信息资料（品种信息、引物信息等）、数据类资料（DNA指纹数据、形态学性状数据等）和图片类资料（形态性状的图片、扩增产物的电泳图等），这也是研究者们继续深入的目标，为中国葡萄栽培育种及种质资源的保护利用提供理论依据和技术支持。

另外，将葡萄DNA指纹图谱技术与QTL（数量性状基因座）定位相结合，可为研究葡萄重要性状的基因定位、克隆产生巨大促进作用。刘震东[6]采用SSR和SRAP两种分子标记技术分别构建了‘红地球’‘双优’‘北冰红’的分子遗传图谱，对其杂交后代、自交后代的抗寒性进行鉴定及QTL定位研究，为抗寒基因的定位、克隆，以及分子标记辅助育种创造了可能性，对提高葡萄抗寒育种水平具有重要意义。

在葡萄酒研究领域，应用色谱指纹图谱技术，根本目的是研究和控制葡萄酒的质量。其意义在于：葡萄酒指纹图谱可以通过保留时间来定性分析酒中某类化学成分的数量与组成，若使用标准品还可以精确定量，为监控葡萄酒质量提供有力的保障。规范葡萄栽培实践，提高葡萄酒生产厂家对产品质量的控制标准。葡萄酒指纹图谱标准的制定，必须建立在对葡萄酒来源的全面了解基础上，即确保酒品质及来源信息的真实准确性。

还有几个问题值得注意：以花色苷为被检测对象进行分析建立指纹图谱的方法，仅适用于红葡萄酒，因为红葡萄酒在皮、汁混合发酵过程中，将大量花色苷留在了酒体中，而白葡萄酒经皮汁分离仅用果汁发酵，花色苷含量很少，不适用此法。红葡萄酒中花色苷种类、含量和比例，主要受葡萄品种影响，所以在建立酒龄和产地的指纹图谱分析中，首先要避免葡萄品种差异的影响。除了葡萄品种，还有一些外在因素对酒中多酚类物质有影响，比如陈酿条件不同，特别是较高的温度会减少游离花青素含量，造成酒龄指纹图谱的改变，影响鉴定的准确性，所以葡萄酒HPLC指纹图谱鉴定酒龄的方法目前仅适用于同一生产厂家的葡萄酒，特别是在商标上标明年份的红葡萄酒酒龄的区别鉴定，即适合葡萄酒生产企业用来制定企业标准，利于品质控制。