HIV-1 Rev蛋白在病毒复制中的功能

王宇佳，米泽云，丁寄葳，岑山



HIV-1 Rev蛋白在病毒复制中的功能

王宇佳，米泽云，丁寄葳，岑山

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所免疫生物学室

人获得性免疫缺陷病毒 HIV-1 编码的 Rev 蛋白由 116 个氨基酸组成，分子量为 19 kD，主要定位在细胞核中。Rev 具有三个不同的功能区：N 端的第 35 ~ 50 个氨基酸之间编码了一个精氨酸富集区域（arginine-rich-motif，ARM）作为 Rev 的核定位信号（nuclear localization signal，NLS）。Rev 的 NLS 区域主要负责蛋白的核定位功能以及与 Rev 反应元件（Rev response element，RRE）的茎环 RNA 序列特异性相互作用，介导 Rev 单体间聚合[1]。Rev 的第 10 ~ 24 个氨基酸是核扩散抑制信号（nuclear diffusion inhibitory signal，NIS），主要维持 Rev 的功能以及 Rev 在细胞核的亚细胞定位。第三个活性区域位于第 73 ~ 84 个氨基酸之间，是异亮氨酸富集的区域，包含一个核输出信号（nuclear export signal，NES）。该区域直接与细胞染色体维持蛋白 1（chromosomal region maintenance 1，CRM1）相互作用。研究表明在 HIV-1 的复制过程中，Rev 执行了多种生物学功能，其中包括病毒 RNA（vRNA）的核输出、增强病毒蛋白的表达水平，促进 vRNA 基因组的核体化[2]，以及负调控 HIV-1 整合[3]。本文主要围绕 Rev 在病毒复制早期和晚期的功能展开论述。

1 辅助 vRNA 从细胞核输出到细胞质

在 HIV-1 复制过程中，早期的病毒 mRNA 转录本经完全剪接，形成各种编码早期蛋白质（Tat、Rev 和 Nef）的 mRNA；然而晚期的转录本剪接不完全或者未剪接，直接被转运到细胞浆中作为表达 Gag 等病毒蛋白的模板或作为基因组包装入病毒颗粒。由于病毒不完全剪接或未剪接的转录本中含有内含子，其核输出需要 HIV-1 Rev 蛋白和 RRE。RRE 为 HIV-1 基因组里的一段 250 bp 的序列，位于结构基因 Env 中。Rev 可以特异性地识别和结合 RRE。RRE 通过链内氢键折叠，可以形成由 5 个茎环组成的稳定 RNA 二级结构。其中茎环结构域 I 是一个构成不完美的双螺旋，其主要功能是维持 RRE 功能结构，同时具有较低亲和力的 Rev 结合位点[4]；结构域 IIB 中具有一个富含嘌呤核苷酸的不对称凸起，它是 Rev 初始结合的强亲和位点[5-6]；结构域 III ~ V 也可能有助于结构的稳定，但对 RRE 的活性影响较小。然而，关于 RRE 的精确二级结构一直存在争议。研究表明，RRE 包含 4 个或 5 个茎环的替代结构，这两种已发布的结构在 Rev 结合位点之外的区域中有所差异[7]。

Rev 蛋白利用其 NLS 和 NES 信号在细胞质和细胞核之间穿梭，通过结合不完全剪接或未剪接的转录本中的 RRE，可将 mRNA 转运到细胞质中并进行翻译。在这个过程中一些宿主蛋白起到了辅助性的作用，其中比较重要的两个宿主因子是 CRM1 和输入蛋白 β（importin-β，IMPβ）。另外，染色质链接鸟苷酸交换因子（regulator of chromosome condensation，RCC1），能够水解 Ran-GTP，为 Rev 核质穿梭提供能量[8]。在细胞核中，单个 Rev 单体与 RRE 结构茎 IIB 中的高亲和力位点结合并开始装配，并将额外的 Rev单体通过蛋白质-RNA 和蛋白质-蛋白质相互作用招募 Rev 单体，共聚化形成四聚体（Rev/RRE/CRM1/Ran-GTP）[9]，随后四聚体复合物和核孔相互作用，穿过核孔输出到细胞质中。在四聚体复合物通过核孔的过程中需要招募一种细胞—— GTPase 激活蛋白（RanGAP），促进 Ran-GTP 释放能量变成 Ran-GDP，从四聚体中释放出来[10-11]，四聚体穿越核孔，随后 RanBP1 的参与导致 CRM1 从四聚体中释放，CRM1 通过核孔输入到细胞核中发挥作用。此时 Ran-GDP 和细胞质中的 Rev 结合，防止 Rev 重新和 CRM1 结合。随后 Rev 的 NLS 区域和细胞质中的 IMPβ 结合促进含有 RRE 的 mRNA 释放到细胞质中进行翻译。随后三者复合物穿过核孔将 Rev 运输到细胞核中发挥作用。在细胞核中，Ran-GTP 的链接导致 Ran 和 importin 复合物的解离，游离出单体 Rev，继续在细胞核中结合含有 RRE 的 mRNA 发挥其功能[11-12]。

2 增强 HIV vRNA 的翻译

Rev 不仅在含有 RRE 的 RNA 的细胞核输出中起到了重要的作用，同时还能增强 mRNA 的翻译水平[13]。早期的研究发现，某些突变的 Rev 并不改变 vRNA 在细胞核和细胞质中的比例，但是严重影响蛋白表达[14]。过表达 Rev 可以提高 Env-RRE mRNA 在细胞质中的水平约两倍，但 Env-RRE 蛋白表达水平可提高 50 倍之多[15]。与之类似，在 HeLa 细胞中，Rev 分别增强 Gag 的 RNA 和蛋白水平 4.4 和 845 倍。这些研究结果提示，Rev 除了可以辅助病毒未剪切的 RNA 输出到细胞质中，还可以增强 vRNA 的表达[16]。

mRNA 的有效翻译需要结合多聚核糖体。研究发现表达野生型或者功能缺陷的Rev 对于多聚核糖体中的完全剪接的病毒 RNA 水平没有影响，但非剪接形式的病毒RNA 在突变型 Rev 存在的情况下明显减少。这些结果提示 Rev 可能在 RNA 核输出完成后与含有 RRE 的 RNA 在细胞质中继续结合，并进而促进其进入多聚核糖体。Rev-RNA 结合实验发现在细胞质中不完全剪接或未剪接的 Gag/pol、Vif 和 Vpr mRNA 都和 Rev 具有很强的结合，但是完全剪接的 Tat 和Rev RNA 并没有类似的情况；当 RRE 缺失时，Rev 和 RNA 的结合基本上消失[2]，这进一步验证了 Rev 通过 RRE 介导结合 RNA 的设想。同样的，只有当 Rev 存在的情况下，才能在多聚核糖体组分中检测到 Gag mRNA。尽管不同检测系统和细胞类型可能会对结果产生不同的影响，但多数证据都表明 Rev 对于不完全剪接的 HIV-1 RNA 的翻译有促进作用[2]。

之前已经发现有很多宿主因子参与到 Rev 介导的 vRNA 的核输出过程中，同样，对于 Rev 的翻译调控，现在也确定一些候选宿主因子在此过程中起到了一定的促进作用。真核细胞翻译起始因子 5A（eukaryotic initiation factor，eIF5A）是一个可以和 Rev 具有相互作用的细胞蛋白，可以引发病毒 mRNA 的翻译[17-18]。多聚腺嘌呤结合蛋白 1（poly(A)-binding protein1，PABP1）可能与 Rev 协同增强 vRNA 的稳定性[19]，参与 polyA 尾招募核糖体，进而增强依赖于 Rev 的 HIV-1 RNA 翻译。除此之外，在 Rev 存在的情况下，RNA 解旋酶（RNA helicase A，RHA）可以和 RRE 结合，促进含有 RRE 的 mRNA 的翻译。Pura 蛋白可以在细胞质中和 Rev、RRE 共定位，促进含有 RRE 的基因表达[20]。

3 增强 HIV 病毒基因组 vRNA 的核体化

除了上述 Rev 的功能之外，Rev 还可以促进 HIV-1 基因组的包装。在病毒的组装过程中，病毒的 vRNA 通过位于 5'UTR 的包装信号和前体蛋白 Gag 中的核衣壳（NC）区域相互作用，将病毒基因组带入至病毒颗粒中。最初确定的 HIV-1 包装信号位点是 5'UTR 中的 stem-loop 3，其缺失导致包装效率降低约 20 倍[21]。然而，仅仅依靠这个区域的存在并不能引发基因组的包装，这就提示还有其他的序列或者结构参与该过程[2]。研究发现在 Rev 缺失的时候，HIV-1 病毒载体的包装效率和滴度下降到 3%，然而细胞质 RNA 水平仅仅降低到 44%。相反，当使用缺乏 5'UTR 和 RRE 的密码子优化 HIV-1 表达系统时，Rev 存在与否并不影响包装效率和滴度[22]。此外，过表达 Rev 蛋白可以提高 Rev 缺失 HIV-1 未剪接 RNA 的细胞质水平 5 倍左右，然而包装的 HIV-1 RNA 拷贝数提高 4500 倍。上述研究结果表明，Rev 对于 vRNA 的包装具有促进作用。目前关于 Rev 促进 HIV-1 基因组包装的机制还未完全阐明，推测 Rev 可能通过 loopA 将 RNA 转运到特殊的位点，在该位点可以使病毒基因组 RNA 有效地包装到子代病毒颗粒中[2]。

Blissenbach 等[23]为了确定 Rev 对原病毒 RNA 包装效率的影响，进行了定量 RT-PCR 分析。在存在或不存在Rev 质粒表达的情况下，用 HIVRev-/4xMS2、Tat 表达质粒和 Hgpsyn 共转染 293T 细胞，用靶向 gag 的引物进行定量 RT-PCR 测量细胞质和病毒颗粒中全长 HIV-1 RNA 的量。转染后，Rev 增加了 HIV-1 未剪接 RNA 的细胞质水平，提取的 RNA 从 8.9 × 107增加到 4.9 × 108拷贝/μg。与此相比，Rev 增强 HIV-1 RNA 包装的拷贝数约为4500 倍。因此推断 Rev 可以一定程度增强基因组 HIV-1 RNA 的包装。

4 干扰 HIV cDNA 整合到宿主细胞

早期的工作发现，以较高的 MOI 的 HIV-1 感染易感细胞时，虽然可以产生大量的病毒 cDNA，但是只有一个或者几个能够整合到宿主细胞的基因组里，提示病毒的整合过程有负调控机制[3]。Levin 等[3]发现在靶细胞中病毒 cDNA 的整合频率是受 Rev 调控的。在这个实验中，靶细胞感染野生型的 HIV 和 Rev 缺陷的 HIV 颗粒，尽管产生拷贝数相同的病毒 cDNA，但是感染缺失 Rev 的 HIV 病毒颗粒发生整合的频率比感染野生型效率高 5 倍。同时，当在细胞稳定表达 Rev 的时候，这两种病毒的整合效率都明显下降，初步证明病毒 cDNA 的整合频率是受 Rev 调控的。目前通过体外链接实验，双分子荧光互补实验以及免疫共沉淀实验均已证明 Rev 和整合酶（IN）具有相互作用。Rosenbluh 等[24]研究发现，IN 和 Rev 在酵母细胞中可以相互作用并形成稳定的 Rev-IN 复合物，其相互作用可抑制 IN 酶活性从而限制了整合作用[25]，这项工作描述了一种限制 HIV-1 整合的新颖的调节机制。随后实验发现，除了 IN 之外，Rev 也可以和参与病毒整合的宿主蛋白 p75 相互作用，进而抑制其辅助整合的功能[26]。原则上讲，HIV-1 的辅助蛋白往往对 HIV-1 的复制起到促进作用，然而 Rev 抑制病毒整合对于 HIV-1 感染是否有利呢？目前已证实 HIV-1 的 Env、Nef 和 Vpu 蛋白能够下调细胞中 CD4 受体，从而阻止超级感染的发生。因此，HIV-1 可能利用 Rev 抑制病毒 cDNA 整合，阻止基因毒性和超级感染的发生，进而促进病毒的复制[18]。

5 展望

目前临床使用的抗 HIV 药物多为蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂和整合酶抑制剂，这些靶向病毒的药物容易产生耐药性，因此寻找抑制 HIV 的新方法是一项持续而重要的工作。综上所述，Rev 在 HIV-1 的生活周期中执行着十分重要的作用，通过对 Rev 生物学功能及作用机制的不断深入研究，Rev 有可能成为新的抗 HIV 药物治疗的靶点。

[1] Jayaraman B, Mavor D, Gross JD, et al. Thermodynamics of Rev-RNA interactions in HIV-1 Rev-RRE assembly. Biochemistry, 2015, 54(42):6545-6554.

[2] Groom HC, Anderson EC, Lever AM. Rev: beyond nuclear export. J Gen Virol, 2009, 90(Pt 6):1303-1318.

[3] Levin A, Hayouka Z, Friedler A, et al. A novel role for the viral Rev protein in promoting resistance to superinfection by human immunodeficiency virus type 1. J Gen Virol, 2010, 91(Pt 6):1503- 1513.

[4] O'Carroll IP, Thappeta Y, Fan L, et al. Contributions of individual domains to function of the HIV-1 Rev response element. J Virol, 2017, JVI.00746-17.

[5] Dayton ET, Konings DA, Powell DM, et al. Extensive sequence- specific information throughout the CAR/RRE, the target sequence of the human immunodeficiency virus type 1 Rev protein. J Virol, 1992, 66(2):1139-1151.

[6] Rausch JW, Le Grice SF. HIV Rev assembly on the Rev response element (RRE): a structural perspective. Viruses, 2015, 7(6):3053- 3075.

[7] Sherpa C, Rausch JW, Le Grice SF, et al. The HIV-1 Rev response element (RRE) adopts alternative conformations that promote different rates of virus replication. Nucleic Acids Res, 2015, 43(9): 4676-4686.

[8] Bischoff FR, Ponstingl H. Catalysis of guanine nucleotide exchange on Ran by the mitotic regulator RCC1. Nature, 1991, 354(6348):80- 82.

[9] Hoffmann D, Schwarck D, Banning C, et al. Formation of trans-activation competent HIV-1 Rev:RRE complexes requires the recruitment of multiple protein activation domains. PLoS One, 2012, 7(6):e38305.

[10] Behrens RT, Aligeti M, Pocock GM, et al. Nuclear export signal masking regulates HIV-1 Rev trafficking and viral RNA nuclear export. J Virol, 2017, 91(3):e02107-e02116.

[11] Bischoff FR, Klebe C, Kretschmer J, et al. RanGAP1 induces GTPase activity of nuclear Ras-related Ran. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91(7):2587-2591.

[12] Budhiraja S, Liu H, Couturier J, et al. Mining the human complexome database identifies RBM14 as an XPO1-associated protein involved in HIV-1 Rev function. J Virol, 2015, 89(7):3557-3567.

[13] Toro-Ascuy D, Rojas-Araya B, García-de-Gracia F, et al. A Rev-CBP80-eIF4AI complex drives Gag synthesis from the HIV-1 unspliced mRNA. Nucleic Acids Res, 2018, 46(21):11539-11552.

[14] Romanov VI, Zolotukhin AS, Aleksandroff NN, et al. Posttranscriptional regulation by Rev protein of human immunodeficiency virus type 1 results in nonrandom nuclear localization of gag mRNA. Virology, 1997, 228(2):360-370.

[15] Emerman M, Vazeux R, Peden K. The rev gene product of the human immunodeficiency virus affects envelope-specific RNA localization. Cell, 1989, 57(7):1155-1165.

[16] Hadzopoulou-Cladaras M, Felber BK, Cladaras C, et al. The rev (trs/art) protein of human immunodeficiency virus type 1 affects viral mRNA and protein expression via a cis-acting sequence in the env region. J Virol, 1989, 63(3):1265-1274.

[17] Mancone C, Grimaldi A, Refolo G, et al. Iron overload down-regulates the expression of the HIV-1 Rev cofactor eIF5A in infected T lymphocytes. Proteome Sci, 2017, 15:18.

[18] Grewe B, Uberla K. The human immunodeficiency virus type 1 Rev protein: ménage à trois during the early phase of the lentiviral replication cycle. J Gen Virol, 2010, 91(Pt 8):1893-1897.

[19] Martineau Y, Derry MC, Wang X, et al. Poly(A)-binding protein-interacting protein 1 binds to eukaryotic translation initiation factor 3 to stimulate translation. Mol Cell Biol, 2008, 28(21):6658- 6667.

[20] Bolinger C, Yilmaz A, Hartman TR, et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res, 2007, 35(8): 2629-2642.

[21] Harrison GP, Miele G, Hunter E, et al. Functional analysis of the core human immunodeficiency virus type 1 packaging signal in a permissive cell line. J Virol, 1998, 72(7):5886-5896.

[22] Brandt S, Blissenbach M, Grewe B, et al. Rev proteins of human and simian immunodeficiency virus enhance RNA encapsidation. PLoS Pathog, 2007, 3(4):e54.

[23] Blissenbach M, Grewe B, Hoffmann B, et al. Nuclear RNA export and packaging functions of HIV-1 Rev revisited. J Virol, 2010, 84(13): 6598-6604.

[24] Rosenbluh J, Hayouka Z, Loya S, et al. Interaction between HIV-1 Rev and integrase proteins: a basis for the development of anti-HIV peptides. J Biol Chem, 2007, 282(21):15743-15753.

[25] Levin A, Hayouka Z, Helfer M, et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One, 2009, 4(1):e4155.

[26] Meehan AM, Saenz DT, Morrison JH, et al. LEDGF/p75 proteins with alternative chromatin tethers are functional HIV-1 cofactors. PLoS Pathog, 2009, 5(7):e1000522.

岑山，Email：shancen@hotmail.com

2018-12-05

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.013