羊肚菌药理活性对缓解运动应急性疲劳的应用

刘 菁，宫美凤，张立臣，黎宇翔

（北京航空航天大学 体育部，北京 100191）

羊肚菌是当前被认为是具备美味且珍稀性的食用菌。通过近年来有关研究学者的发现，羊肚菌能够提升人体的免疫力，抗衰老，抗疲劳等，具有重要保健功效。随着当前社会经济水平的提升以及人们生活质量要求提升，同时，生活节奏的加快，使得人们出现了疲劳过度或者体力透支，身体抵抗力降低的问题。进一步导致在实际工作过程中工作效率降低，身体受到严重的健康威胁。因此，人们越来越重视抗疲劳和保健品的发展。它分为单个组分，如细胞外多糖、细胞内活性物质，细胞内多糖等、并可在紧急摄入小鼠中的不同成分后确定。身体在运动过程中产生抗疲劳，并延长运动增强运动能力的相关效果。通过研究发现，与对照组相比，细胞内多糖羊肚菌细胞外多糖具有显着的抗疲劳作用。该结果能够为之后医学行业研发羊肚菌多糖抗疲劳保健品，提供重要参考。

近年来，许多研究学者都重视了羊肚菌的重要价值。其中，孙晓明在负重游泳实验中观察了小鼠的负重游泳时间、血清尿素氮、血乳酸等生理指标。结果发现，相比于羊肚菌子实体粉能够延长其运动时间，减少血乳酸的水平和血清尿素氮水平，它可以增加肝糖原的量，并表现出更好的抗疲劳作用。段玉鹤等结果发现，羊肚菌的胞内外多糖能够从一定程度上延长小鼠的运动时间，具有计量依赖性。通过大量的药理研究证明，羊肚菌具有良好的抗疲劳效果，可以通过现代工艺技术将其制为保健品，延缓人们的抗疲劳对改善生活质量具有重要意义。在本文中我们基于段巍鹤等人的研究成果，对羊肚菌药理活性对缓解运动应急性疲劳的应用进行深入分析。

1 实验材料与方法

首先，段义和等人选择的菌株。使用的试剂是小鼠抗Motus单抗，其经过初步腹水处理，HRP标记的山羊抗小鼠抗体和HRP标记的山羊抗兔抗体，其购自北京生物技术有限公司，由美国sigma公司购买一些所需的试剂，包括PDA液体培养基，其具体成分为200 g马铃薯、20 g葡萄糖、1 g磷酸二氢钾、0.5 g硫酸镁、3 g蛋白胨，加水至1mL体积并消毒20 min。所有其他试剂均购自国家公司的分析试剂。在研究中所使用的仪器有恒温振荡培养箱，超净工作台，离心机，酶标仪，紫外分光光度计，超声破碎仪，电泳槽。

研究方法上，首先需要活化群种，并对菌种进行鉴定和扩大培养。在菌株的活化中，将菌株的试管倾斜在无菌操作台中培养到无菌培养皿中。将培养基在PDA固体培养基中培养，并在23℃下培养1周，以获得羊肚菌的菌丝体培养物。其次，进行菌丝鉴定，并通过加入一定量的无菌生理盐水和海砂将取适量培养物得到的菌丝培养半小时。然后，将研磨液倒入离心管中，以300 r·min-1的转速离心5 min，取上清液进行抗原检测。研磨后得到的抗原分别用缓冲液稀释，梯度控制在5倍和10倍。在12孔酶标仪上其中1到4孔可以利用5倍稀释抗原，第5孔为 PBS缓冲液对照，6至10个孔是10倍抗原稀释液，11个孔是羊肚菌阳性抗原对照，12个孔是空白对照。依次向各个酶标孔中加入100 µL的50倍稀释的单抗体，常温孵育1h之后分别用 PBS洗涤三次，甩干之后向各个孔加入100 µL经过2 000倍稀释的 HRP羊抗鼠抗体，常温孵育1h之后再用 PBS洗涤3次，干燥后，向每个孔中加入100 µL底物，避免在黑暗中15 min。通过酶标仪检测每个孔中的OD值以实现扩增的培养。经过上一步的研究，检测，便能够鉴定羊肚菌的菌丝。可在无菌工作站上将其转移至含有无菌PDA培养液的100 μL三角烧瓶中。用密封膜密封，置于21℃恒温振荡培养箱中，并以115 r·min-1温育5 d。并做好标记，收集菌丝培养物的培养液进行下一步实验操作。提取羊肚菌和细胞内活性物质的细胞内和胞外多糖。首先，当提取羊肚菌的胞外多糖时，我们选择300 mL过滤并离心，并将无菌菌培养液置于50℃恒温搅拌下。将体积浓缩为150 mL，采取sevage的方法去除菌丝中的蛋白，将去蛋白后的培养液加入三倍体积中的乙醇溶液中，置于零下20℃进行蛋白沉淀，24 h会析出絮状白色物。经过离心，其条件为400 r·min-1，离心20 min获得白色沉淀，加入50 mL溶菌水，进行溶解，并在50℃的水浴锅中除去乙醇获得胞外多糖。在提取胞内多糖时，经过液体培养的菌丝利用蒸馏水洗涤两次，并获得菌丝沉淀物，对沉淀按照比例50∶1加入去离子水，置于85℃恒温水浴中2 h，离心后除去羊肚菌丝。离心之后将上清液置于50℃的恒温水锅中，使体积浓缩为一半。离心去沉淀，上清沉淀处理方法与胞外多糖的处理方法一致，能够获得胞内多糖，并进行下一步实验操作。在提取细胞内活性物质时，采用液体培养得到的羊肚菌菌丝，用蒸馏水洗涤2次，用超声波破碎菌丝体。将其功率设置为180 W，破碎条件为每破碎10 s，间隔15 min，循环破碎30次，利用冰块快速降温的方法或者停机操作，避免破碎液温度较高。同时，在菌丝完全破碎后，也可以通过光学显微镜检查，并将上清液离心。上清液是羊肚菌细胞内相中的活性物质，并在下一步中研究。

测定葡萄糖浓度曲线以及多糖浓度。在该研究中，苯酚硫酸法可用于测定溶液中多糖的浓度。每个需要100 mL每毫升葡萄糖标准溶液和6%苯酚溶液100 mL。绘制葡萄糖标准曲线，分别取0、0.2 mL、0.4 mL。将0.6 mL、0.8 mL和1 mL置于相应的管中，并加入蒸馏水至体积为2 mL。加入1 mL 6%苯酚溶液并充分混合后，加入2 mL浓硫酸，再在沸水浴中加热反应15 min。将其放于冰块中快速冷却，以空白设计作为对照。使用1 cm比色皿在490 nm的波长下测量吸光度。绘制标准曲线时，以葡萄糖质量为横坐标，以吸光度为纵坐标，得到标准曲线回归方程。根据线性范围，我们对样品浓度进行调整，进而检测样品的吸光值。由线性方程获得所测样品中的多糖浓度，为了能够进一步明确羊肚菌中包内胞外多糖以及胞内活性物质，有效缓解疲劳作用浓度。我们选择8只ICR成年小鼠称重，然后将它们分成实验组和对照组，并在实验组中包括3组。胞内多糖，胞外多糖，胞内活性物质这三个组，每组共计2只小鼠。将上述组份提取液分别配制为多糖浓度为14.4 mg·mL-1的溶液，以蒸馏水作为对照组。给小鼠腹部空腹后，每只小鼠需要注入1 mL的液体。测量小鼠游泳时间，比较不同组分和对照组中不同浓度多糖对游泳时间的影响。并根据结果进行下一步多糖浓度的检测。

测定羊肚菌中胞内多糖，胞外多糖，胞内物质在抗疲劳上的作用。选择20只经过1 d断食之后的成年ICR小鼠对其进行称重，将其平均分为4组，每组共计5只小鼠，可以将其分为对照组，胞外多糖，胞内活性物质组。根据上述实验所确定具有显著提高运动时间的胞内外多糖组，胞内活性物质组所灌注的多糖浓度，空腹灌胃之后，每只小鼠需要灌注1 mL，测定每只小鼠游泳时间，最后将所得数据利用统计学软件进行单因素分析。

2 研究结果

首先，需要对菌株的ELISA进行间接鉴定。通过试验我们可以知道经过活化培养之后的羊肚菌丝经过破碎处理后，做ELISA时，通过5倍和10倍稀释，P/N值均大于2.1为阳性。在实验结果中阳性，阴性对照组成立，进一步说明经过活化培养之后，我们所获得的菌丝确定是羊肚菌菌丝。用水提法所获得的多糖浓度测定结果如上表所示。初步选择羊肚菌胞内外多糖以及胞内活性物质，抗疲劳作用的最佳浓度。我们可以通过实验发现，在对小鼠灌胃液多糖浓度为14 mg·mL-1时，相比于多糖浓度为4 mg·mL-1，小鼠游泳时间明显增加。与在对羊肚菌保内外多糖以及胞内活性物质抗疲劳作用进行分析时，我们可以通过数据可知，胞外多糖组相比对照组来说具有明显的统计学意义，说明胞外多糖组与对照组的小鼠进行运动时间比较具有显著差异，而胞内多糖组与对照组相比也具有统计学意义，但胞内活性物质与对照组相比，小鼠游泳时间无统计学意义。

3 羊肚菌药理活性缓解运动的应急性疲劳分析

根据很多研究学者的发现，我们分析羊肚菌的发酵液中多糖与体内多糖溶液，在应急摄入之后，小鼠的游泳时间相比对照组来说具有明显的统计学意义，说明这种多糖溶液能够提升应激性抗疲劳作用。当羊肚菌的胞内多糖和胞外多糖浓度控制为14 mg·mL-1时，此时可以从一定程度上延长小鼠的游泳时间。在相同状态下，高浓度的羊肚菌多糖，相比低浓度的羊肚菌多糖来说能够明显延长小鼠的游泳运动时间。但相比来说，胞内物质与对照组的小鼠进行游泳时间比较不具有统计学意义。这一结果也说明了影响小鼠应激性抗疲劳的主要是羊肚菌的胞内外多糖，而胞内活性物质中含有与胞内多糖抗疲劳性相互拮抗的有效成分。然而针对该机理还需要后续进行深入探索，通过上述的研究也进一步验证了羊肚菌中的多糖能够明显提升应急性抗疲劳，具有一定的保健功能。我们所采用小鼠游泳实验是在相关研究基础上，根据实验目的进行一次性应急灌喂，而这种方法能够获得直观数据，并且在对抗疲劳保健品使用上具有一定的指导意义。该研究所采用的方法能够为之后研究应急性抗疲劳作用，保健品研发提供参考依据。根据之前的文献，在上述研究中采用了免疫学检测对不同菌丝进行菌落鉴定，进而能够提高结果的可靠性，同时所获得的应急性灌胃小鼠游泳时间相比羊肚菌多糖抗疲劳程度来说，这一结果更具有可靠性。然而，我们分析该结构可能与所研究使用的菌种长期传代培养，菌丝活性，多糖组分含量有一定的相关性。

4 结语

总而言之，羊肚菌是一种珍贵的药用真菌，具有良好的经济和药用价值，在食品，保健，医疗方面具有广阔的市场应用前景。研究学者发现羊肚菌中含有多种化学成分，包括多糖，酶，有机酸，氨基醇等。随着研究技术的发展，研究人员应当致力于羊肚菌物质和分离纯化活性单体，创新药理实验，进一步说明羊肚菌具有良好的免疫调节和抗疲劳性能。在后续研究中，应当针对羊肚菌的药理活性机制展开深入的探索，能够为新型药物研发提供方向。除此之外，由于当前还无法实现规模化的人工栽培，因此还需要进一步加快规模化人工培养羊肚菌的力度。