基因工程在植物抗寒性研究中的应用

谭 克 赵福顺 姜奇峰 张 倩 金玉忠 王宇微

（吉林省蔬菜花卉科学研究院 吉林·长春 130033）

植物的低温危害包括冷害和冻害。植物组织在冰点以上所受到的低温伤害称之为冷害（chilling injury）[1]。冷害是低温对机体的生理损伤。除低温外，对植物体的损伤程度取决于低温维持时间的长短。所以，选育抗寒品种是抵御低温危害的有效途径，提高耐寒性也成为目前保护地栽培品种选育的研究重点。随着生物技术在作物育种领域的应用，借助基因工程来获得抗寒种质资源已成为重要的育种途径。本文利用现有文献资料，对国内外植物抗寒基因工程研究进展做一番简要的综述。

1 植物冷诱导基因及其转录因子

植物冷诱导基因（cor）是一种诱导基因，COR基因仅在某些条件(例如低温、短日等)下被激活以产生冷调节蛋白。从而提高了植物的耐冷性。1970年Weiser提出低温锻炼可引起基因表达的改变[2]。后来发现，大多数植物在低温锻炼过程中都含有调寒物质。当分析相应蛋白的物理和化学性质时，发现它们与植物的抗寒性密切相关，从而这些蛋白被称为冷调节蛋白（cold regulated proteins，CORPs） 和 冷 驯 化 蛋 白 （cold acclimation proteins，CAIPs)。为了实现概念上的统一，马建忠将该类型基因统称为冷诱导基因[3]。这些基因的共同特点是在零度以上低温诱导表达，然后在常温下停止或减少表达。目前从诸如拟南芥、油菜、第一杂交、菠菜、马铃薯、大麦、小麦、黑麦、胡萝卜、水稻和番茄这样的喜冷或冬季作物中获得了近100个冷诱导的基因[4-5]。在众多的冷诱导基因中，拟南芥冷调控基因COR15a的功能是研究较多的，它在拟南芥的抗寒性中起着重要作用。COR15a基因的过表达可使拟南芥的冷冻温度降低1℃，提高拟南芥原生质体的抗寒性。切断信号肽后的COR15a成熟蛋白可直接作为一种保护蛋白，防止叶绿体的脂质双尾膜形成无序的不定结构，提高叶绿体的抗寒性，维持其低温下的光合能力，同时提高质膜和其他内膜的冷稳定性[6]。Artus等研究表明，COR15a的表达增加了细胞膜的稳定性，植株叶绿体耐低温能力较对照提高1～2℃。

转录因子也称反式作用因子，CBF（C-repeat binding factor）转录因子是一个基因家族，其包括CBF1、CBF2、CBF3、CBF4、CBF5和CBF6基因，它们在植物低温信号通路[7-8]中起着重要作用。通过与下游调控基因启动子DRE顺式作用元件结合，介导上述逆境信号在植物体内的转导，在诱发植株对低温、盐分和干旱的响应中具有重要作用[9]。CBF1和CBF3直接调节它们的下游靶基因，也可通过CBF2将信号向下游传递。

在低温驯化过程中，CBF基因的表达是在低温条件下快速诱导表达的[10]。通常在遭受低温后15min内CBF的表达即被启动[11]。金万梅等。以根癌农杆菌介导的叶盘法将拟南芥冷诱导转录激活基因CBF1导入草莓中，通过PCR鉴定和Southern杂交，证明提高了草莓对低温胁迫的抗性[12]。谭克等从抗冷性强的黄瓜叶片RNA中扩增并克隆了冷诱导基因转录因子CBF1，将其与CaMV 35S启动子和Nos终止子融合后构建植物表达载体，利用花粉管通道法将其转入黄瓜，获得了具有一定耐寒能力的黄瓜再生植株，总转化率达到3.75‰[13]。孟平红等构建了含有冷诱导转录因子CBF 3的植物表达载体，并通过农杆菌介导的方法转入茄子，初步建立了抗寒茄子的再生转化体系[14]。Hsieh等将拟南芥CBF1基因导入番茄后发现转基因植株叶片过氧化氢酶活性显著高于对照，过氧化氢含量显著低于对照，番茄抗寒性得到改善[15]。Haake等人构建植物表达载体将CBF4基因转移到拟南芥中。结果表明转基因作物的抗寒性和抗旱性都得到了提高[16]。刘荣梅等采用农杆菌介导法将CBF3基因导入烟草中，获得了Southern阳性转基因烟草，通过对幼苗生理生化指标的测定，表明转基因烟草在低温胁迫下的抗寒性强于对照[17]。

2 抗氧化酶活性基因

在低温胁迫过程中，氧的利用能力降低，过量氧在代谢过程中转化为活性氧（ROS），而活性氧对植物有毒害作用。这种活性氧在包括电子转移的生化过程中是正常代谢物，但必须及时去除以维持低水平的动态平衡，否则，会引起膜脂过氧化、DNA损伤和蛋白质变性，以及膜脂肪酸不饱和的减少，导致细胞损伤或死亡。在植物中，有一个完美的抗氧化防御系统，它具有清除活性氧的能力，其主要有酶促和非酶促两类。酶促防御系统主要包含超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）等；非酶促防御系统包括谷胱甘肽（GSH）、维生素E、抗坏血酸（ASA）、胡萝卜素等抗氧化物质。而SOD是清除ROS的第一个重要的抗氧化酶，起着关键作用。目前研究表明高等植物中有三种SOD酶：线粒体Mn-SOD、叶绿体Fe、Cu/Zn-SOD和细胞质Cu/Zn-SOD。McKersie等人从烟草中克隆了Mn-SOD的cDNA，并构建植物表达载体转入苜蓿的线粒体和叶绿体中，提高了植物中SOD的含量和活性，通过抗冷性实验发现转基因苜蓿的越冬存活率获得了较大提高，对除草剂二苯乙醚的抗性也显著增强[18]。Gupta等从豌豆中克隆了Cu/Zn-SOD基因，并将其转入烟草，结果表明转基因植株叶绿体中SOD基因过量表达，抗坏血酸过氧化物酶（APX）含量增加，转基因植株的抗寒性得到显著增强[19]。Ohkawa等用基因枪法将APX基因导入黄瓜，经GUS检测证明其基因已成功转入，与对照相比，转基因植物的抗寒性显著增强[20]。

3 抗冻蛋白基因

抗冻蛋白（anti freeze protein，AFP）是一种能增强抗冻能力的蛋白质类的总称。其能以非线性形式使水溶液的冰点降低，从而帮助有机体抵御冰冻环境。抗冻蛋白是20世纪60年代从南北极动物血清中发现的，当低温导致结晶形成时，AFP即会活化，其能特异地吸附于冰晶表面，抑制冰晶的重晶化，阻止晶格的形成,以及阻止小的冰晶结成更大的冰晶，从而减轻冰晶在冻融的动态变化中对生物体造成伤害。而一旦温度升高，AFP就会完全丧失它的活性。

抗冻蛋白在鱼类和昆虫中的研究开始比较早，1991年，Hightower等将北极鱼类的抗冻蛋白基因导入烟草和番茄中，结果表明，转基因作物的抗寒性增强[21]。黄永芬等通过花粉管通道法将美洲拟鲽的抗冻蛋白基因导入番茄，结果表明转基因植株的生长势优于对照，致死温度比对照组低2℃[22]。梁娜等利用内生菌回接的方法将拟步甲昆虫小胸鳖甲的抗冻蛋白MpAFP基因转入棉花，其获得的转基因植株的抗寒性高于对照，且随着低温处理时间的延长，抗冻蛋白的保护作用逐渐降低[23]。与动物抗冻蛋白研究相比，植物抗冻蛋白研究起步较晚。1992年，Griffith等人在加拿大首次发现植物内源AFP，标志着植物抗冻蛋白研究的开始，随后陆续从多种植物中获得了具有热滞效应的AFP[24]。1994年费云标等人从常绿抗冻植物沙冬青叶片中分离出了抗冻蛋白[25]。Wallis等将植物凝集素基因和AFP基因一起构建植物转化载体，并将其转入马铃薯。结果表明，在-2℃低温条件下，转基因马铃薯叶片的电解质渗透率比对照低2倍以上[26]。Huang等将树状抗冻基因DAFP21转入拟南芥，转基因植株的抗冻性比对照提高最多达3.3℃[27]。Worrall等人从一种低温诱导的胡萝卜中提取并克隆了AFP蛋白，并将其导入烟草中，转基因植株的抗寒性明显高于对照，所获得的转基因烟草提取物能抑制冰晶的生长[28]。陈佳佳利用农杆菌介导法将矮沙冬青抗冻蛋白基因AnAFP转入玉米未成熟幼胚中，结果表明，抗冻蛋白基因在玉米中异源表达，显著提升了玉米的抗寒能力[29]。

4 渗透调节基因

当植物遭受低温、干旱和其他胁迫时，体内将产生一些渗透调节物质来防止失水和维持体内的水平衡。这些物质包括可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱和游离氨基酸。在低温胁迫条件下，植物通过促进渗透压调节物合成酶的表达，增加体内这些物质的积累，从而调节细胞内的水平衡，避免低温伤害。任晓平等测定了低温胁迫下番茄幼苗叶片游离脯氨酸含量和脯氨酸脱氢酶活性。结果表明，耐冷品种o-33-1脯氨酸积累量增加，而感冷品种游离脯氨酸积累量减少，说明脯氨酸积累量在一定程度上反映了番茄的抗寒性[30]。Pilon-Smits等从细菌中克隆到胆碱氧化酶COX基因，分别转入拟南芥、油菜和烟草中，提高了转化植株中的甜菜碱含量和植株苗期低温耐受性[31]。王关林等从枯草芽孢杆菌中分离克隆出果聚糖合酶（levansucrase）基因sacB，采用农杆菌介导法转入番茄植株，结果表明，转基因植株具备了良好的抗寒性[32]。

5 膜稳定性基因

1973年，根据细胞膜结构和功能与抗寒性的关系，Lyons提出了著名的“膜质相变冷害假说”。产生冷害的根本原因普遍认为是细胞膜系统的受损，细胞膜系统是植物中第一个感受外界刺激的地方。且膜系统也是植物细胞与外界环境进行物质交换的通道和许多生理生化反应的场所，因此膜系统的健康完整对植株的正常生长发育非常重要。研究表明，低温冷害与生物膜系统类脂分子的相变密切相关[33]，细胞膜中不饱和脂肪酸的含量会影响相变温度。近年来的研究进一步证明，脂肪酸去饱和代谢关键酶基因的引入可以提高植物的抗寒性。Kodama等人将脂肪酸去饱和酶基因Fad 7导入烟草并过量表达，植物中不饱和脂肪酸含量增加，抗寒性相应提高[34]。于爱群等通过对高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因的研究表明，低温可激活脂肪酸脱氢酶基因的转录，而脂肪酸脱氢酶是不饱和脂肪酸的关键合成酶[35]。Gombos等发现不饱和脂肪酸含量的降低可抑制植物的光合作用并降低其抗寒能力[36]。Ariizumi等人将Fad 7基因导入水稻，不仅提高了植株的抗寒性，而且提高了低温下的光合速率和生长速率[37]。此外其它在拟南芥和菠菜中转入脂肪酸去饱和酶的研究也证明增强了植株的抗寒性。

6 展望

参与植物抗寒的生理生化代谢过程非常复杂，目前国内外在低温逆境生理、低温信号转导研究方面取得的一系列重要进展，克隆了与植物抗寒相关的一些基因，初步描述了植物低温信号转导的原理图，为选育耐低温品种以及在栽培上寻找对抗低温的措施提供了科学依据，然而，由于植物抗寒基因工程属于新的研究领域，还存在许多有待进一步研究的问题：①由于植物的抗寒性是多基因控制的特点，前期的研究主要集中在单一基因上，转化植物的抗寒性受到限制。今后应将重点放在多基因转化，各基因之间相互作用，基因与各转录因子之间相互关系等更深入的领域。②研究植株的耐寒机理和筛选耐寒材料时，必须进行抗寒性鉴定，而所采用的鉴定指标的准确性及合理性是对育种材料抗寒性进行正确评价的关键。目前转基因作物还未设立专用的鉴定方法，大多数都是沿用非转基因作物的抗寒性评价方法，今后应有针对性地建立转基因作物抗寒评价方法。③在抗寒分子育种研究过程中，除了继续寻找新的抗寒基因和途径外，还可以尝试对转基因植株采用常规杂交手段进行性状筛选与改良，通过基因工程技术与传统育种手段相结合创造出抗寒性强的作物新品种。综上所述，利用基因工程技术提高植物抗寒性的研究具有广阔的发展前景。