高效液相色谱法测定饮料中乙酰磺胺酸钾含量的不确定度分析

◎ 段 羚

（包头市食品药品检验检测中心，内蒙古 包头 014030）

乙酰磺胺酸钾又名安赛蜜、AK糖，是一种无热量高甜度甜味剂，过量摄入会对人体造成严重损害。为了保护大众的健康，国标对其添加量有严格的控制，而高效液相色谱法为其常用检测方法，为保证测定结果的准确性、可靠性，本文对用该法测定饮料中乙酰磺胺酸钾的测量结果的不确定度进行了评定，建立数学模型、分析不确定度来源，使其结果能如实反应出测量结果的准确性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1260安捷伦高效液相色谱仪-二极管阵列检测器（德国安捷伦公司）；乙酰磺胺酸钾溶液标准物质（北京鸿蒙标准物质技术有限责任公司）；甲醇（色谱纯）；乙酸铵（优级纯）。

1.2 试验条件

色谱柱：C18，4.6 mm×250 mm，5 µm（迪马公司）；柱温：30 ℃；流量：1.0 mL·min-1；进样量：10 µL。

流动相：流动相A为甲醇；流动相B为0.02 moL·L-1；乙酸铵水溶液；A∶B=5∶95。

检测波长：230 nm。

1.3 分析流程

1.3.1 标准溶液的配制

吸取1.00 mg·mL-1的标准溶液2.50 mL于25 mL容量瓶中，用水定容至25.00 mL，配得浓度为100.00 µg·mL-1标准使用液。用5.00 mL刻度移液管分别吸取1.00、2.00、3.00、4.00 mL以及5.00 mL标准使用液，用水分别定容至10.00 mL，配得浓度分别为10.00、20.00、30.00、40.00 µg·mL-1以及 50.00 µg·mL-1的标准溶液，因而标准系列为10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、100.00 µg·mL-1。

1.3.2 样品处理

称取12 g饮料样品，在电炉上除去CO2后加水稀释，定容到25.00 mL，经0.45 µm水系滤膜过滤，进液相色谱仪。用外标法定量测定。

2 数学模型及不确定度的来源

2.1 数学模型[1-2]

式中，X为样品中乙酰磺胺酸钾的含量，mg·mL-1；m为称取试样的质量，g；V为样品最终定容体积，mL；C为样品中乙酰磺胺酸钾的测定量，µg/mL。

2.2 不确定度来源

从测量过程和数学模型分析，饮料中乙酰磺胺酸钾含量不确定度主要来源于重复性测量、标准溶液、标准曲线拟合和样品处理操作过程。

具体的不确定度分量如下：测量重复性引入的相对标准不确定度ur（rep）；标准溶液引入的相对标准不确定度ur（p）；标准曲线拟合线性方程引入的相对标准不确定度ur（c）；样品处理过程中使用天平称量引入的相对标准不确定度ur（m）；样品处理过程中定容体积引入的相对标准不确定度ur（v）[3-9]。

3 不确定度的评定

3.1 测量重复性引入的相对标准不确定度ur（rep）

独立重复性测定饮料中乙酰磺胺酸钾含量8次，测得数据如表1。

表1 样品测定结果表

实验测得的标准偏差s按贝塞尔公式计算为：

由于在相同的试验条件下测8个样品，取其平均值作为报告结果，为A类评定，所以由重复性测量引入的不确定度分量为：

测量重复性引入的相对标准不确定度为：

3.2 标准溶液引入的相对标准不确定度ur（p）

3.2.1 标准物质溶液引入的相对标准不确定度urel（sta）

实验室采用的为北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司提供的1.00 mg·mL-1的乙酰磺胺酸钾溶液标准物质，查标准物质证书：相对扩展不确定度为1%，k=2，为B类评定，则标准溶液引入单位相对标准不确定度：

3.2.2 量器校准引入的不确定度

该过程中使用的一系列玻璃量器，JJG196-2006常用玻璃量器检定规程中对其容量允许差有明确规定，按矩形分布换算成标准偏差，即标准不确定度[3]，由此可得量器校准引入的相对不确定度见表2。

表2 量器校准引入的不确定度表

由表2可知稀释过程中量器校准引入的合成相对 标准不确定度为：urel（量器）

3.2.3 环境温度变化引入的不确定度

实验室的环境温度很难准确控制到20 ℃，室温在±3 ℃变动，此时液体的膨胀率明显大于容量瓶的体积膨胀，因此只考虑前者[5]。水的体积膨胀系数为2.1×10-4，产生的体积变化为：±（量取体积×液体膨胀系数×ΔT），按其服从矩形分布考虑，k=，所以标准系列配制过程环境温度变化引入的不确定度见表3。

表3 标准系列配制过程环境温度变化引入的不确定度表

由表3可知标准系列配制过程环境温度变化引入的合成相对标准不确定度为：

由3.2.1、3.2.2、3.2.3可知，标准溶液引入的合成相对标准不确定度为：

3.3 标准曲线拟合线性方程引入的相对标准不确定度ur（c）

分别对浓度为10.0、20.0、30.00、40.00、50.00 μg·mL-1以及100.00 μg·mL-1的6个乙酰磺胺酸钾标准溶液进行测定，每个浓度测定6次，得到相应的峰面积，用最小二乘法拟合，得到直线方程A=a+bC（a为截距，b为斜率）和相关系数R。试验结果见表4。

表4 标准曲线各浓度点的峰面积实测值及线性方程表

其中b=29.938 48，a=12.502 41，R=0.999 97。应用该曲线进行测量时，对样品进行了1次测量，即P=1，测得处理中乙酰磺胺酸钾的浓度C为53.12 μg·mL-1，则C的标准不确定度：

S（A）为参考标准峰响应值A的不确定度，m为每个浓度点重复测定的次数，m=6；n为标准溶液浓度点的数量，n=6；m（n-2）为自由度；P为C的测量次数，P=1；N为标准溶液的测定次数，N=36。

将测量结果带入公式得：

S=5151.34

S(A)=7.95

u(c)=0.27 μg·mL-1

标准曲线拟合线性方程引入的相对标准不确定度：ur(c)=u(c)/C=5.08×10-3

3.4 天平称量引入的相对标准不确定度ur(m)

用百分之一天平进行称量，其分度为0.01 g，称量样品12.30 g，取均匀分布，引入不确定度分量u（m）=0.01/=5.77×10-3得

ur(m)=u(m)/m=4.69×10-4

3.5 定容体积引入的相对标准不确定度ur(v)

样品用A级，50 mL单标线容量瓶定容，定容过程中产生的不确定度有以下2个来源：①容量瓶体积校准引入的相对标准不确定度。②温度与校准温度不同引入的不确定度[6-7]。

3.5.1 容量瓶体积校准引入的不确定度

A级，50 mL单标线容量瓶其容量允许差为±0.05 mL，按矩形分布换算成标准偏差，即标准不确定度==0.05/=±0.029 mL；相对标准不确定度为±0.029 mL/50 mL=±5.80×10-4

3.5.2 温度与校准温度不同引入的不确定度

水的体积膨胀系数为2.1×10-4，ΔT=3，产生的体积变化为：±（量取体积×液体膨胀系数×ΔT），按其服从矩形分布考虑，k=，所以标准系列配制过程环境温度变化引入的不确定度为：±（50 mL×2.1×10-4×3）/=±1.82×10-2mL；相对标准不确定度为3.64×10-4。所以：

4 合成相对标准不确定度

以上各不确定度分量相互独立、互不相关，由此可得合成相对标准不确定度urel(X)为：

5 扩展不确定度

5.1 扩展不确定度

扩展不确定度可由合成标准不确定度乘以包含因子，取置信水平95%，则k=2。

试样中乙酰磺胺酸钾含量测定的相对扩展不确定度 u=urel(X)×k=0.044。

5.2 测量结果不确定度报告

表1中计算得试样中乙酰磺胺酸钾含量：

X=216.598 mg·kg-1

故其扩展不确定度：

U=216.598 mg·kg-1×0.044=9.530 mg·kg-1

乙酰磺胺酸钾含量：（216.598±9.530）mg·kg-1。

6 结论

通过实验分析，用高效液相色谱法测定饮料中乙酰磺胺酸钾过程中，测定结果的不确定度主要来自于测量重复性、标准溶液配置过程和标准曲线。因此在用该法检测样品时应严格控制试验条件，并确保实验室计量器具的准确性。