人食管下括约肌G蛋白耦联受体的表达及作用机制

张珂 张聪 高静 王海辰 韩彩娜 张微 刘俊峰

食管下括约肌(lower esophageal sphincter，LES)的位置大致在食管胃结合部，而与其他哺乳动物不同的是人食管下端宽约3 cm的环形增厚平滑肌束，包含有两种肌纤维，即靠近胃小弯一侧的勾状纤维肌束(clasp fibre)和靠近胃大弯一侧的套索纤维肌束(sling fibre)。最初结构成分特征由Allgower等于1979年首次报道。目前多数学者通过大量解剖研究对于两种纤维束结构特征的共识是，钩状纤维形状为半环形，套索纤维斜行走行[1]。通过多种神经、体液因素调节，两种肌纤维同膈肌脚共同形成了食管下高压带(high-pressure zone，HPZ)这一生理抗反流解剖结构，具有防止食管—胃反流发生的生理功能。

目前认为人LES的功能受三种机制共同调节。

第一是神经调节机制，人脑接受到刺激信号后进行信息整合分析，然后将信息传至迷走神经背核神经元胞体，经过进一步分析整合后再通过迷走神经的末梢将神经刺激传递到人食管下括约肌。兴奋性和抑制性传导通路末梢均与LES肌层内肠道运动神经元(enteric motor neurons，EMN)形成突触连接，共同调节人LES的收缩与舒张[2-3]。

第二是人LES自身调节机制，也称为肌源性调节机制。是人LES肌层中神经细胞丛和神经纤维网共同调节而形成的调节机制。这种调节机制是通过对离体肌条静息张力的研究发现的。体外实验发现，肌条的部分静息张力不能被河豚毒(tetrodotoxin，TTX)作用后消除，只可以被硝普钠所消除。该实验表明静息长度张力效应是人LES的自身调节机制作用所产生。

人LES除受神经刺激调节和自身调节控制以外，第三个重要的调节因素就是体液调节机制。在人LES上体液调节主要是通过激素配体与G蛋白耦联受体结合而发挥作用的。因此，全面掌握人LES上G蛋白耦联受体的表达量和表达类型，并进一步明确G蛋白耦联受体激动或拮抗后的平滑肌行为对于研究食管动力性疾病尤为重要[4]。

一、G蛋白耦联受体的结构

跨膜信号转导有三类主要方式：①特殊刺激激活通道蛋白质完成信号转导；②G蛋白耦联受体介导的跨膜信号转导；③受体酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase，RPTKs)介导的跨膜信号转导。第二类信号转导机制由G蛋白耦联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)介导，其胞内的G蛋白(G-protein/GTP binding protein)，又称鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(guanine nucleotide-Binding protein)，是细胞膜表面上的蛋白质，为信号转导细胞跨膜信息传递系统的起始端，几乎全部多肽类激素配体是通过与G蛋白耦联受体结合后，在突触后细胞中生成第二信使再经信号转导通路进而调节细胞生理功能的。另外一些激活的G蛋白耦联受体可调控一些通道状态。

1.结构：G蛋白耦联受体的结构为膜内在蛋白(integral membrane protein)，每个受体有7个跨膜α螺旋的结构域。当膜外结构与配体结合后，膜内部分发生构象变化，G蛋白结合位点与G蛋白相互作用以实现胞外信息向胞内信息的传递。G蛋白是胞质侧膜蛋白，其与膜受体耦联的部分通常由3个亚基组成异源三聚体。其中包含45 000的α亚基、35 000 的β亚基和70 000的γ亚基，总分子质量为100 000左右。α亚基为催化作用单元，当G蛋白处于失活状态，α亚基结合一个分子的GDP；当受体蛋白激活后G蛋白α亚基和GDP分离，再与一分子GTP结合。这时结合GTP的α亚基同β、γ亚基分离，G蛋白各亚基处于激活状态，对膜结构的效应酶起作用。效应酶抑制或激活使胞质中第二信使生成减少或增加以实现信号转导。由此可知，G蛋白有两种状态，即结合GDP的αβγ三聚体非活化型状态和α亚基-GTP、β、γ亚基的活化型状态。G蛋白是一个超级家族(GTP-binding protein superfamily)，均包含有异源三聚体和小G蛋白。作为受鸟嘌呤核苷酸调控的信号转导分子，三聚体分子量大；小G蛋白分子量在20 000～30 000水平，相对较小且为单体，其与信号转导之间联系目前尚未发现[5-6]

2.分类：三个主要类型为刺激型G蛋白(stimulatory G protein，Gs)、抑制型G蛋白(inhibitory G protein, Gi)和磷脂酶C型G蛋(PI-PLC-G protein，Gp)。不同类型的G蛋白能与相应的效应酶特异性耦联以实现不同效应。G蛋白没有跨膜结构域，其通过氨基酸残基脂化修饰以锚定在胞膜上。在各种G蛋白亚基中，Linder、Hepler等建议以差别最大的α亚基分类作为G蛋白分类依据。目前通常结合氨基酸序列、G蛋白结构、功能性和进化相似性等几个方面综合判断作为分类依据，主要分为4类G蛋白。其中至少分别存在21、5和8种不同的α、β、γ亚基。α螺旋链主要有αs、αi、αo、αt1、αt2五种类型。cDNA克隆可发现5条α链的原始序列[6-8]。

二、G蛋白耦联受体的功能

不同类型的α亚基均有鸟嘌呤核苷酸结合区，其可与GTP或GDP结合。与鸟嘌呤核苷酸(GTP、GDP)的结合可逆，使G蛋白在G蛋白耦联受体的信号转导过程中发挥“开关”作用。跨膜信息传递有如下步骤：①胞外无刺激信号或配体时G蛋白处异源性三聚体形式失活状态存在。α亚基与GDP紧密结合，β、γ亚基则与α亚基-GDP疏松结合。②外部存在刺激时受体与配体结合，进而导致G蛋白α亚基变化，使得三个亚基紧密结合为αβγ复合物，使GDP与GTP交换。与GTP结合后α亚基与β、γ亚基分离，转化为α亚基-GTP激活态作用于效应器，继而出现细胞内信号转导引起细胞生理变化。③G蛋白α亚基在Mg离子存在时具有GTP水解酶活性，水解后α亚基-GDP再次与β、γ亚基结合重新恢复失活态。上述过程往复循环实现信号跨膜传递，α亚基的GTPase活性高低决定了激活状态持续时间，进而说明了G蛋白在信号转导过程至关重要。G蛋白耦联受体信号通路多数为cAMP和磷脂酰肌醇信号通路。也有研究证实，G蛋白同时参与磷脂代谢的生理过程和光信号转导过程。信号转导过程中G蛋白有信号放大和分子开关两个主要作用。①通常一个受体可以级联放大激活许多G蛋白实现跨膜传递信息；此外，有时细胞外配体与受体结合短暂，难以形成足够的放大作用。而胞内G蛋白激活时间可持续10～15 s，受体配体已经分离时G蛋白仍处于向细胞内传递信号的激活状态。②G蛋白与GTP的结合启动了信号转导通路，因此其具有分子开关作用。此外，G蛋白的共价修饰及其浓度变化同样会改变受体、酶间耦联的有效性。例如，百日咳毒素催化Gi的α亚基ADP核糖基化而降低了GTP-Gi结合力，使Giα亚基不能活化，从而使腺苷酸环化酶保持活化状态。正常生理时，G蛋白与GTP、GDP结合状态可逆，使信号精确、适度地瞬间内传递，而不是持续存在，正负反馈机制一旦被破坏细胞就会出现功能障碍。因此G蛋白在信号转导过程中的放大作用需要控制，不能无限放大，进一步体现了G蛋白的分子开关作用。另外，G蛋白也可诱导细胞调亡。

三、G蛋白耦联受体的主要效应器

1.腺苷酸环化酶系统是研究最早、最多的G蛋白调节效应器之一。受体激活后催化与Gs结合的GDP替换为GTP，导致Gs的α亚基与β、γ亚基分离并释放出AS-GTP活化腺苷酸环化酶，进而催化ATP转化为cAMP。腺苷酸环化酶被Gs激活，被Gi抑制。

2.磷脂酶C是G蛋白的直接效应器，有4个同工酶。5-羟色胺等激素配体与受体结合后经GPLC蛋白转导可激活磷脂酶C。而磷脂酶C可催化胞质侧磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate，PIP2]水解产生二酰甘油(diacylglycerol，DG)与肌醇三磷酸(inositol triphosphate，IP3)。DG与IP3都是细胞内重要的第二信使。其中IP3可进入胞质中的内质网内使Ca2+离子大量释放到胞质中。IP3也可增强胞膜对Ca2+离子的转运促使Ca2+离子内流以提高胞质内Ca2+离子浓度。其还可激活依赖Ca2+-CaM的蛋白激酶(PK)，通过Ca2+-CaM蛋白激酶催化蛋白质磷酸化表现不同的效应。但IP3的寿命仅数秒，可被三种磷酸酶催化变为肌醇，因此是一种短时效信使物质。DG脂溶性强，可活化蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)发挥作用。PKC多肽链上有亲水的催化活性中心和疏水的膜结合区两个功能域。PKC主要分布于胞质，当细胞接收到刺激信号使PIP2分解生成IP3和DG，导致质膜中DG含量瞬间积累。PKC与DG结合在质膜内表面，并在Ca2+和磷脂酰丝氨酸共同作用下使PKC激活，DG的结合还可使PKC对Ca2+的亲和力大幅提高。这就使得在生理浓度Ca2+水平PKC即可被激活，激活的PKC进一步修饰某些蛋白质或酶的磷酸化反应，表现其信息效应。

3.G蛋白调节离子通道：Gαs亚基被证明至少可抑制心肌Na离子通道和调节骨骼肌细胞中的Ca离子通道这两种通道，而Gαi也能抑制Ca离子通道而激活K离子通道。在活化心肌上K离子通道能力方面Gβγ比Gαi更高效。此外，所有G蛋白均能长期调节细胞生长和基因表达，由异源三聚体G蛋白途径转导的信号最终导致核转录因子的磷酸化[5]。

四、G蛋白耦联受体的分类及其在人食管下括约肌上的表达

G蛋白耦联受体的分类：以G蛋白耦联受体一级结构的同源性为分类标准可将其分为A、B、C三系[9]。

1.A族(视紫红质/β肾上腺素受体样受体族)的一级结构和特点：ECL1与ECL2间有二硫键；N末端氨基酸残基数少；TM3胞质面具有保守的DRY基础序列(Asp-Arg-Tyr)；棕榈酰化Cys位于C末端，形成ICL4；ICL3较长；在7跨膜α螺旋结构中包含多个高度保守的氨基酸序列。A族受体以种系发生为判定标准可再分为6个亚族：①速激肽、神经肽Y、胆囊收缩肽、内皮素等；②生物胺受体；③大麻类、腺嘌呤、嗅觉及黑皮素受体；④缓激肽和非脊椎动物的视蛋白受体；⑤互补因子、促性腺激素释放激素、趋化因子等；⑥褪黑激素受体及其他类型受体。

2.B族(胰高血糖素/血管活性肠肽/降钙素受体样受体族)包含有4个亚族：①促肾上腺皮质激素释放因子和降钙素受体；②类胰高血糖素肽、胰高血糖素、血管活性肠肽、分泌素和垂体腺苷酸环化酶活化肽受体；③甲状旁腺激素受体；④Latrotoxin受体。

3.C族包含有主要钙受体、味觉受体、鼻神经外激素受体、γ-氨基丁酸受体、谷氨酸受体这5个亚族。上述各种类型受体广泛分布于体内并参与信号传递、学习和记忆等重要的生理功能，同时与帕金森症、癫痫等疾病的病理发生机制密切相关[10]。

三、调节人LES的主要激素配体及其G蛋白耦联受体表达

人LES的体液调节主要通过激素类配体与受体的结合实现信息传递和生理功能调节。既往多项研究发现，体液中存在的激素类物质可影响人LES的静息张力，进一步研究发现人LES上存在多种G蛋白耦联受体表达。因此推断，通过开发与人LES上G蛋白耦联受体结合的药物可能实现治疗食管动力性疾病的目的。

1.速激肽及NK类受体：张珂等发现在人LES、胃小弯和食管下段环形肌上NK受体均有表达。NK1、NK2和NK3受体分别由TACR1、TACR2和TACR3基因编码，其受体蛋白表达量NK2>NK1>NK3[10]。速激肽类物质包含有神经激肽B(neurokinin B，NKB)、P物质(substance P)和神经激肽A(neurokinin A，NKA)，通过与NK类受体结合以实现调节LES肌张力作用。有作者研究表明，静脉注射P物质使其在血液浓度一过性增高时，随着浓度增加，人LES肌张力随之增大。通过药理学实验发现毒蕈碱受体在此过程发挥主要作用，而静注NKA也有同样效果，但其作用机制并不依赖于胆碱能信号传输系统。另外，多篇文献研究发现，人LES的体液调节速激肽类物质为主要调节因子[11-12]。

2.蛙皮素(bombesin，BBS)：最初研究认为其为中枢神经系统的神经递质，后期实验发现通过诱导各种胃肠激素释放其具有调节LES舒缩作用，并且这种对LES的调节不会被酚妥拉明、阿托品所阻断[14]。BBS相关肽和雨蛙素对正常人LES平均压力有下调作用，而对贲门失驰缓症患者的LES平均压力具有升高作用[14]。但其在所有体液调节中所占比重大小目前尚不清楚。

3.胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)、胃动素和胃泌素也可使人LES收缩。研究还发现CCK静注犬类体内对LES张力无影响，但在犬胃膨胀前静注CCK拮抗剂会降低LES松弛[15]。胃动素作为有22个氨基酸的胃肠多肽激素除了可以使人LES收缩外，还能够使胃肠道动力提高。其作用是通过与LES平滑肌上的胃动素受体结合实现的，这一结合可被阿托品和六甲季铵所拮抗[16-17]。高立平等[18]和Perdikis等[16]在实验中发现，胃泌素可使LES肌张力升高。但Nelson等[19]发现胃泌素可能与胃食管反流病患儿的LES压力下降之间存在重要关联。胃泌素对LES的作用尚须更深入的研究。5-羟色胺、前列腺素、生长抑素β肾上腺素、溶血磷脂酸和促胰液素这几类胃肠道激素类物质受体在人LES上叶均有不同程度表达，但研究发现这些胃肠激素物质对LES的舒缩调节作用均较小[20-23]。

随着研究的不断进展，未来食管胃结合部的功能也会进一步明确。随着神经、自身和体液激素对LES的调节作用不断被发现，未来食管动力性疾病的药物治疗方法可能会取代外科手术。