巨噬细胞在心律失常发生中的作用及机制

訾刘留 赵庆彦

巨噬细胞是机体固有的免疫细胞,不仅能够分泌细胞因子,参与炎症反应、免疫调节、适应性免疫应答的启动,还能通过炎症反应重叠,增殖,改建完成组织修复过程,参与心脏重塑过程[1]。巨噬细胞数量和表型的异常,心脏的功能、结构都会发生改变[2]。研究已显示,巨噬细胞的极化与分化在房性、室性、交界性等心律失常发生中起重要作用[3－5]。笔者就巨噬细胞对心律失常发生中的作用机制作一综述。

1 心脏巨噬细胞来源

不同表型的心脏巨噬细胞可以从血液,脾脏和骨髓的单核细胞库中募集[6],也可以由心脏固有巨噬细胞原位增殖[7]。Molawi等[8]分析了小鼠出生后心脏巨噬细胞的动态变化,发现出生后的一周内,胚胎前体细胞来源的CX3CR1＋心脏巨噬细胞分化为MHCII＋和MHCII-两类细胞,这种来源于CX3CR＋胚胎前体的巨噬细胞持续到成年,但在出生后比例迅速下降且随着小鼠周龄增加,巨噬细胞原位增殖能力下降,心脏巨噬细胞的增殖主要由单核细胞招募完成。然而,Epelman等[9]研究与以上不同,他们认为在稳定状态下巨噬细胞主要通过固有巨噬细胞原位增殖,而在巨噬细胞严重消耗或炎症状态下,巨噬细胞会依靠单核细胞招募增殖,遗传命运图谱显示心脏固有巨噬细胞主要来源于卵黄囊和胚胎单核祖细胞。

2 巨噬细胞分型

巨噬细胞根据其功能分为多种表型,M1和M2属于巨噬细胞在炎症状态下的二元分类。M1型巨噬细胞,又被称为经典激活的巨噬细胞,认为其以促炎作用为主,表面标记有CD68＋、CD86＋、MHCII＋类分子等。M2型又被称为替代激活的巨噬细胞,认为其以抗炎作用为主,表面标记有CD68＋、CD163＋、FRβ＋等[10]。M1和M2型只是巨噬细胞分化的两个极端状态,有一些细胞是处于M1和M2型巨噬细胞功能之间的状态[11]。最近研究发现,巨噬细胞还存在混合型表型(Mox)和M4型巨噬细胞。核因子E2相关因子2(Nuclear Factor E2-related Factor 2,Nrf2)诱导Mox巨噬细胞,响应氧化组织损伤,其可能在动脉粥样硬化发展和慢性炎症的过程中扮演重要的角色[12]。Gleissner等[13]研究发现通过使用趋化因子配体-4(CXCL-4)诱导的巨噬细胞分化,其表达的产物与M1和M2型巨噬细胞有很大的差异,后期被命名为M4巨噬细胞。

3 M1型和M2型巨噬细胞极化调控

M1和M2可以相互转化。脂多糖、Thl相关细胞因子、C-C趋化因子等诱导形成M1,表现为促炎作用,可促进炎症细胞外基质降解,分泌白细胞介素-1β(IL-1β),诱导基质金属蛋白酶-9(MMP-9)合成,其中MMP-9可以激活转换生长因子-β(TGF-β),促进成纤维细胞增殖。糖皮质激素、Th2相关细胞因子诱导形成M2型巨噬细胞,表现为抗炎作用,可促进细胞外基质的合成、细胞增殖、血管新生[14]。目前主要从转录机制方面着手调控极化,例如NF-k B、AP-1、IRF5、IRF8、AKT1、SOCS2等参与了Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)诱导M1型巨噬细胞极化过程,而STAT6、PPARIRF4、C/EBP-B、KLF4、AKT2、SOCS3参与M2型巨噬细胞极化过程[15]。除从转录机制之外,还有一些其他调节极化途径。巨噬细胞A类清道夫受体(SR-A)是重要的炎症调控因子,能诱导巨噬细胞向M2型极化,发挥抗炎、抗纤维化、抗心律失常作用,敲除SR-A基因的小鼠与对照组比较观察到巨噬细胞向M1型极化,且发生恶化的心律失常及纤维化[16]。同样地,IL-4和IL-13也能促进巨噬细胞向M2型极化[17],而Cihakova等[18]敲除小鼠的IL-13基因后发现其与空白组相比,M2型巨噬细胞含量明显下降,M1型巨噬细胞释放的各种炎性因子如IL-1β、IL-1,干扰素等含量明显上升,患心力衰竭和重症心肌炎的概率明显上升;敲除IL-4的小鼠与空白组相比虽然M2型巨噬细胞含量下降,却没有明显地致心力衰竭和重症心肌炎作用,说明了IL-13与IL-4相比更具心肌保护作用,这可能与IL-13能限制心肌炎症有关。Singla等[19]将糖尿病(DM)鼠随机分为假手术组、心肌梗死(MI)组和梗死后注射成纤维生长因子-9(fibroblast growth factor-9,FGF-9)组,术后2周行超声心动图和免疫组织化学检查后发现FGF-9应用有助于DM后巨噬细胞向M2型极化和相应炎症因子的增加,改善心脏重塑,提高心脏功能。Zhao等[20]发现也可以从阻止炎症性巨噬细胞从血液中招募来调控巨噬细胞,他们敲除CCR2基因或者抑制CXCR6可以抑制炎症后期血液中的单核细胞招募至心脏转换成促炎型巨噬细胞,有助于改善心脏重构。

4 巨噬细胞与房性心律失常

Hulsmans等[21]将小鼠随机分为空白组、高血压模型组和衰老模型组,发现与空白组相比,高血压模型组和衰老模型组小鼠内心肌巨噬细胞含量均显著增高,接下来他们将巨噬细胞分泌的IL-10与成纤维细胞共同培养,观察到纤维母细胞激活,胶原沉积,提示巨噬细胞可导致心肌纤维化和舒张期功能障碍,与心房结构重构有关[22]。Ito等[23]对心房颤动(简称房颤)和无房颤患者进行尸检免疫组化分析,发现与无房颤患者相比,房颤患者被标记的巨噬细胞与纤维化心肌在心房心内膜下明显并行存在,间接证实房颤中巨噬细胞与纤维化之间密切相关。房颤时巨噬细胞数量明显增加,且拉伸心房肌细胞模拟心房增大,与没有拉伸的心房肌细胞相比,巨噬细胞浸润也明显增加[24]。Liew等[25]给小鼠持续注射肿瘤坏死因子-α(TNF-α)后发现其能抑制缝隙连接蛋白40(CX40)的表达继而心房发生电重构,提示巨噬细胞能通过分泌TNF-α[26]抑制CX40从而参与了心房的电重构。Li等[27]通过蛋白质免疫印迹技术发现房颤患者巨噬细胞活动抑制因子(MIF)蛋白明显增加且CX43蛋白下调。随后他们将小鼠心房肌细胞与重组-巨噬细胞活动抑制因子(r-MIF)体外分别培养15、30、45 min,蛋白质免疫印迹发现MIF以一种时间依赖性的方式刺激心房肌细胞产生含磷的细胞外活动调节蛋白激酶1/2(ERK1/2),再通过ERK1/2活化来调控CX43表达下降,从而诱发房颤。Sun等[3]收集房颤患者的右心耳组织,免疫荧光实验后观察到其促炎性巨噬细胞数量明显增加。同时他们在小鼠慢性房颤动物模型观察磷酸二钠脂质体清除巨噬细胞后对房颤的影响,结果发现巨噬细胞清除后心房有效不应期延长和L型钙离子通道电流增加,明显升高房颤阈值,减少心房电重构,降低房颤发生率。他们进一步发现通过鼠注射脂多糖(LPS)后巨噬细胞增加能抑制小鼠心房肌颤动蛋白(QKI)表达,而将敲除IL-1β的巨噬细胞与心房肌细胞培养有助于QKI上调,随后通过RNA免疫沉淀(RIP)发现QKI能与钙离子通道蛋白α1C亚基编码基因(CACNA1Cm RNA)结合,且通过腺病毒转染在小鼠体内高表达QKI后发现感染的心肌细胞的CACNA1C的表达水平高于未感染的心肌细胞。该项研究提示促炎性巨噬细胞是通过分泌IL-1β抑制QKI的表达,QKI与L型CACNA1Cm RNA的结合减少,CACNA1C表达水平下降和L型钙离子通道电流减少,加重心房电重构,引发房颤。

5 巨噬细胞与室性心律失常

De Jesus等[28]发现MI后巨噬细胞增加与室性心律失常发生密切相关。他们首先将33只小鼠冠状动脉左前降支(LAD)结扎致MI后,随机选择12只敲除Apo E后给予高脂饲料喂食为动脉粥样硬化组,7只每日注射LPS(10 ug/day)为急性炎症组,剩余14只作为空白组。他们发现与空白组相比,动脉粥样硬化组和急性炎症组的CX43表达下降2倍、IL-1β表达增加3倍,免疫荧光技术观察发现发现两组的巨噬细胞数量较空白组明显增加,其产生的IL-1β和金属蛋白酶-7(MMP-7)可协同作用降解CX-43,导致缓慢传导[29],易发室性心律失常。Yin等[30]在犬MI模型中根据流式、蛋白印迹、QPCR、免疫组织化学、ELISA等技术发现巨噬细胞能够分泌神经生长因子(nerve growth factor,NGF),而NGF作为连接炎症反应和交感神经再生的纽带,活化Notch信号通路使巨噬细胞向M1型极化,从而加重MI后交感神经重构,提高室性心动过速的发生率导致室性心律失常。同样地,Wernli等[31]为了观察巨噬细胞清除后对交感神经增生的影响,将鼠随机分为MI组、MI后巨噬细胞清除组及假手术组。他们发现与假手术组相比,MI组的巨噬细胞、T细胞数量显著增加,交感神经分布密度增加2倍,而MI后巨噬细胞清除组的巨噬细胞减少69%、成纤维母细胞数量减少23%,T细胞无明显变化。他们进一步研究发现MI后巨噬细胞清除组的NGF含量明显下降,交感神经密度降低至未梗死前水平,心肌纤维化明显改善,室性心律失常发生率降低,提示清除巨噬细胞对MI的室性心律失常发生具有明显的保护作用。Beiert等[4]将小鼠随机分为MI组,MI后低剂量注射松弛素组(75u·kg－1·d－1,持续两周)和对照组,发现使用低剂量的松弛素能够介导M2型巨噬细胞的表达,产生抗炎作用和抗纤维化作用,从而降低MI后的室性心动过速发病率。Monnerat等[32]应用链佐霉素(STZ)构建DM鼠模型,发现与空白组相比DM组心脏内的巨噬细胞内Toll样受体2(toll-like receptor 2,TLR2)表达上调,且巨噬细胞分泌IL-1β增加,电生理数据显示动作电位时程延长,钾离子电流减慢,肌质钙离子释放增加,延长复极,心室易发室性心律失常。为了探究其内在机制,他们将大鼠离体心室肌细胞与IL-1β共同培养24 h,发现与空白组比较,其细胞心律失常活性指标自发收缩事件(NSE)的数值显著增高,而使用IL-1β受体拮抗剂可以治疗DM引起的室性心律失常,同时也降低了DM引起室性心律失常的敏感性,证明了IL-1β可促进室性心律失常发生率。他们进一步构建了敲除TLR2基因的DM小鼠,发现与单纯DM组小鼠相比,敲除TLR2基因的DM小鼠心脏巨噬细胞分泌的IL-1β分泌明显减少,室性心律失常发病率降低,提示TLR2可诱导巨噬细胞分泌IL-1β介导室性心律失常发生。

6 巨噬细胞与房室结功能

Hulsmans等[5]发现巨噬细胞在房室结正常电传导中起作用,其数量的变化与房室结传导阻滞密切相关。他们通过流式细胞技术发现在小鼠心脏的房室结末梢和房室结束中聚集着大量的心脏固有巨噬细胞,且与左室游离壁的巨噬细胞平均表面积数量相当。将心脏固有巨噬细胞与房室结心肌细胞一起体外培养,发现巨噬细胞与心肌细胞去极化耦合一致,且清除房室结中巨噬细胞,会导致房室结传导阻滞,在体表心电图上表现为房室文氏阻滞。接下来他们通过电子显微镜和免疫荧光进一步研究发现巨噬细胞是通过缝隙连接和连接蛋白43(CX43,位于心肌细胞与巨噬细胞解剖接触位置)与心肌细胞相连,引发传导信号的电荷同步变化,缩短动作电位时程,加速细胞膜电位去极化,减少心电折返活动,提高房室结传导效率,加快房室结传导。心脏电传导通路需要巨噬细胞参与,具体原因机制尚未被完全阐明。当然,在发现巨噬细胞这一重大生理功能时,我们也要清楚地认识到Hulsmans实验的局限性。小鼠和人类之间表达连接蛋白的种类是不同的,例如小鼠高表达一种形成超小电导通道的连接蛋白CX30.2,而人类只低表达其人直系同源物CX31.9,甚至连此也不表达[33]。故尽管此是第一个显示巨噬细胞参与心脏正常电传导的研究,但巨噬细胞在人类心脏电传导中的作用仍是未知的,值得去探索的一个充满无限可能的一个领域。

7 小结

目前研究已提示,巨噬细胞与心律失常的发生、发展密切相关。通过干预巨噬细胞在心脏的分布、极化分化等手段能够作为我们未来治疗心律失常的新思路,但是巨噬细胞与心律失常潜在机制还未被完全了解,尚有待进一步阐明。