14个八仙花品种亲缘关系的ISSR分析

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(西北农林科技大学风景园林艺术学院，陕西 杨凌 712100)

八仙花属(Hydrangea)又名绣球属，是绣球科中最大的属，原产我国，栽培历史悠久，全世界大约有73个种[1-2]，我国有47种和11变种[3]。八仙花花形丰满有致，花色种类繁多，且花色可随基质和水分酸碱度变化而变化，观赏期长达6个月左右，观赏性极佳，主要用作盆花[4-5]、切花[6-7]和干花[8]，在园林中也应用广泛[9-10]，此外还具有药用价值[11-15]与生态价值[16-17]。目前欧洲地区的八仙花新品种选育研究处于世界领先地位，已选育出500多个八仙花栽培品种，我国八仙花盆花和切花品种均从国外引进，育种工作严重落后，国内关于八仙花新品种选育研究的报道很少[3]。

目前，国内有关八仙花的研究主要集中在种质资源[18]、引种驯化[19-20]、繁殖栽培[21-22]、花期调控[23]、化学分析[24]等方面，而关于该属植物分类研究的指标一般是从最初的表现形态学性状方面进行的，很少有利用分子标记技术对八仙花品种分类的系统研究[25-26]。李艳香[27]采用SRAP分子标记技术研究了绣球属植物的11份野生种和8份栽培品种的亲缘关系。

ISSR是一种多态性高且方便快捷的分子标记技术，目前在多种植物的亲缘关系研究和遗传多样性研究的应用极为广泛[28-32]，而利用ISSR分子标记对八仙花品种的亲缘关系的研究尚未见报道。本研究利用ISSR分子标记技术研究了14个八仙花品种的亲缘关系，以期为八仙花新品种的杂交选育提供分子水平的理论依据。

表2 对14个品种样本进行扩增的ISSR引物

引物序列(5’-3’)退火温度(℃)扩增条带总数多态性条带数多态百分比(%)UBC900 ACT TCC CCA CAG GTT AAC ACA 53665583.33UBC854TCT CTC TCT CTC TCT CRG535050100UBC891HVH TGT GTG TGT GTG TG53514791.67UBC834AGA GAG AGA GAG AGA GYT53534483.33UBC876GAT AGA TAG ACA GAC A53666091.67UBC895 AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC53514791.67UBC843CTC TCT CTC TCT CTC TRA53676191.67UBC873 GAC AGA CAG ACA GAC A53745675总计478420

1 材料和方法

1.1 采 样

实验材料采集于八仙花栽培温室，所用植物材料来自昆明杨月季园艺有限责任公司(表1)，按照种群采样法采集样本，每个品种采集10个样本，在液氮中速冻后-70 ℃储存备用。

表1 14个八仙花品种的名称

编号名称学名1花园蕾丝H.‘Huayuanleisi’2爱莎H.‘Aisha’3无尽夏新娘H.‘Wujinxiaxinniang’4紫水晶H.‘Zishuijin’5月亮石H.‘Yueliangshi’6精灵H.‘Jingling’7宝石H.‘Baoshi’8蒂沃利H.‘Diwoli’9罗斯H.‘Luosi’10阿尔卑斯山H.‘Aerbeisishan’11经典红H.‘Jingdianhong’12绿色夏天H.‘Lvsexiatian’13圣代草莓H.‘Shengdaicaomei’14粉钻H.‘Fenzuan’

1.2 样品总DNA提取

将-70 ℃储存的叶片取出后加液氮研磨，利用试剂盒提取叶片总基因组DNA，利用紫外分光光度计(Bio-RAD SmartpecMT 3000)检测总DNA浓度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA质量，并将其用ddH2O稀释至50 ng/μL在-20 ℃冰箱中储存备用。

1.3 引物筛选及扩增

实验采用ISSR引物为沃尔森生物工程技术服务有限公司参照哥伦比亚大学UBC公司公布的ISSR引物序列所合成，在49条植物通用引物中用每个品种的八仙花DNA样本进行筛选，选出了适合八仙花PCR扩增的8条重复性好且扩增条带清晰的引物(UBC 900、UBC 854、UBC 891、UBC 834、UBC 876、UBC 895、UBC 843、UBC 873)。

利用PCR仪(北京君意公司生产)进行PCR扩增，反应体系如下：1μL引物(10μmol/L)、1μL总DNA(50 ng/μL)、10.5μL ddH2O、 12.5μLTaqmix。首先94 ℃预变性5 min，经过94 ℃ 45 s、53 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s进行45个循环，72 ℃延伸8 min后于4 ℃冰箱保存。

PCR扩增结束后，以100 bpDNA ladder为参照，在2%琼脂糖凝胶浓度下进行1.5 h 110 V恒压电泳，并用凝胶成像系统(Gene Genius公司)拍照保存和记录数据。

1.4 数据处理

根据扩增得到的电泳图谱，将每一处DNA扩增条带视为一个引物结合位点，在同一水平位置处，有DNA片段迁移记为1，无则记为0，利用Excel软件统计0-1矩阵。再利用POPGENE 1.32软进行遗传参数分析，计算多态位点百分率(PPB，percentage of polymorphic bands)、有效等位基因(Ne，effective number of alleles)，Nei’s基因多样性(H，Nei’s gene diversity)、Shannon’s 信息指数(I，Shannon’s information index)等参数[39]。然后使用NTSYSpc 2.1软件非加权配对算数平均法(UPGMA)对Nei’s遗传距离进行聚类分析[40]，获得14个八仙花品种亲缘关系的树状图。

2 结果与讨论

2.1 ISSR扩增产物多态性分析

通过14个八仙花品种DNA对UBC 49条植物通用引物进行扩增筛选，得到适用于八仙花PCR扩增的8个引物(表2)，得出了条带清晰、带型丰富的电泳图谱(图1)。利用这8个引物分别对14个八仙花品种的样本DNA进行扩增，共有478条扩增条带，包括420条多态性条带；共有位点124个，多态性位点百分率为88.54%。

利用POPGENE 1.32软件计算有效等位基因(Ne)，Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s 信息指数(I)对数据进行分析和计算，结果表明，试供八仙花品种平均有效等位基因(Ne)为1,419 1(0.196 1)，平均Nei’s基因多样性指数(H)为0.282 4(0.103 2)、平均Shannon’s 信息指数(I)为0.448 6(0.131 8)。

表3 14个八仙花品种的遗传距离(对角线下)和遗传相似性系数(对角线上)

12345678910111213141****0.95570.93820.96240.96340.95060.96340.97410.99980.95590.93730.96140.99980.955520.0453****0.94850.95430.97730.93000.97730.93570.95530.99980.94700.95280.95490.999130.06370.0529****0.97710.95190.91980.95160.94570.93970.94900.99970.97660.93830.949240.03840.04680.0232****0.96000.94880.96000.96190.96150.95500.97700.99980.96270.955450.03730.02290.04930.0409****0.91691.00000.95680.96180.97620.94960.95770.96170.974660.05070.07260.08360.05250.0867****0.91690.91630.95110.93000.91880.94780.95020.929770.03730.02290.04930.04090.00020.0867****0.95680.96180.97620.94960.95770.96170.974680.02620.06650.04480.03890.04420.08740.0442****0.97240.93500.94000.96010.97300.933890.00020.04570.06220.03920.03890.05010.03890.0280****0.95540.93880.96060.99950.9551100.04510.00020.05230.04600.02410.07250.02410.06720.0456****0.94810.95400.95540.9998110.06470.05440.00030.02330.05170.08470.05170.05770.06320.0533****0.97700.93790.9487120.03940.04840.02360.00020.04330.05360.04330.04070.04020.04710.0233****0.96220.9548130.00020.04620.06370.03800.03910.05110.03910.02730.00050.04560.06410.0385****0.9556140.04550.00090.05220.04560.02570.07290.02570.06850.04590.00020.05260.04620.0454****

注：1～14为14个八仙花品种。图1 引物UBC 900对14个八仙花品种的ISSR扩增电泳图

2.2 品种间亲缘关系分析

采用POPGENE 1.32软件进行遗传参数分析结果表明，14个八仙花品种间的遗传距离为0.000 2～0.087 4，遗传相似性系数为0.916 3～1.000 0；精灵和蒂沃利间的遗传距离最大，花园蕾丝和圣代草莓之间的遗传距离最小。

2.3 品种间聚类分析

由14个八仙花品种遗传相似性系数的聚类树形图(图2)可知，14个八仙花品种在相似性系数约为0.38 处被明显地聚成两类。类群Ⅰ中包含花园蕾丝、绿色夏天和圣代草莓，类群Ⅱ包含其余11个品种(爱莎、精灵、粉钻、无尽夏新娘、蒂沃利、宝石、阿尔卑斯山、经典红、紫水晶、罗斯、月亮石)。在相似性系数约为0.61处，类群Ⅱ可分为两个亚类群，亚类群Ⅱa包括爱莎、精灵和粉钻，亚类群Ⅱb在相似性系数约为0.89处又可分为3个小组，小组1包括无尽夏新娘、蒂沃利2个品种，小组2包括宝石、阿尔卑斯山、经典红3个品种，小组3包括紫水晶、罗斯、月亮石3个品种。

图2 14个八仙花品种的遗传相似性系数聚类分析图

3 结论与讨论

八仙花属植物的分类研究始于1867年，Maximowicz[33]首次根据植物习性和花瓣分离或连合将该属植物分为绣球组(Sect.Euhydrangea)和冠盖组(Sect.CalyprantheMaxim.)，此后，Rehder[34]、Engler[35]、陈焕镛[36]、McClintock[37]、卫兆芬[1]等都曾修订过该属植物的分类，但对该属植物的研究仅限于形态描述，且现有的关于属内部分品种的分类是以花瓣萼的颜色和外形作为依据来划分的，因此，对于品种的分类有必要借助分子标记技术进一步补充完善。

ISSR是一种基于微卫星发展起来的十分有效的新型分子标记，可对简单重复序列间的遗传信息进行多态性扩增，具有高效稳定的优点[38]，因此该检测方法可对传统的形态学分类起到补充作用。本实验中使用筛选所得的8个引物对14个八仙花品种进行扩增，多态性条带百分比(PPB)为75%，平均Nei’s 基因多样性指数为0.282 4，品种间的差异导致ISSR扩增位点的多态性，说明14个八仙花品种间的遗传变异较为丰富。

本实验通过POPGENE软件分析数据，所得14个八仙花品种间的遗传距离为0.000 2～0.087 4，遗传相似性系数为0.916 3～1.000 0，这些数据表明，这14个品种亲缘关系较近，在聚类分析中可以被聚到一起，且有明显分组。

利用NYSYSpc 2.1软件对14个品种进行聚类分析，发现在遗传相似性系数约0.38处可明显地聚成两类，其中类群Ⅰ包含花园蕾丝、绿色夏天和圣代草莓。 从花序形态差异方面来看，花园蕾丝、绿色夏天与圣代草莓花序呈圆锥状顶生，具有大量不孕花，属于圆锥绣球(Hydrangeapaniculata)的栽培变种，又称大花圆锥绣球；其他品种的花多呈半球形花序(宝石、阿尔卑斯山、紫水晶、月亮石、无尽夏新娘)、伞房花序(爱莎)和伞形花序(经典红)，这与聚类结果基本符合。 由此可见，形态学分类可作为亲缘关系研究的辅助手段。在类群Ⅱ的基础上，从不孕花萼瓣长度和花序直径来看，月亮石、紫水晶花型中等(12～17 cm)，无尽夏新娘、宝石、经典红、阿尔卑斯山花型偏大(14～21 cm)，说明遗传相似性聚类与其形态分类有部分一致性；而在亚类群Ⅱa中，爱莎、精灵与粉钻虽被聚为一类，但遗传相似性较低，在形态学分类上差异较大。在亚类群Ⅱb中，从花色来看，无尽夏新娘为纯白至淡粉色系，经典红、阿尔卑斯山为玫红色系，月亮石、宝石、罗斯为蓝紫色系，紫水晶为绿边紫色系复色花，蒂沃利为白粉色系复色花，这与聚类分析不完全一致。从生理特性来看，无尽夏新娘可在嫩枝上分化花芽，花期比普通八仙花平均长10～12周，耐寒性好于其他品种，但在聚类结果中未显示出良好的区分度。研究结果还表明，14个八仙花品种基因型具有高度杂合性，难以建立基因位点与主要表型性状的联系，还未发现一些与形态特征相关的特意扩增片段，因此ISSR可作为形态学分类的辅助手段。

我国八仙花资源丰富，但研究起步晚，选育新品种的工作严重滞后，而且对于引进的新品种欠缺了解，不利于选育工作的开展。本研究利用ISSR标记技术对14个八仙花品种的亲缘关系进行了初步分析，为进一步研究八仙花品种的分类提供了分子水平的理论依据，同时也为八仙花新品种的选育提供了参考。