茶树花粉离体萌发条件优化及活力快速检测

2019-01-02 05:41,,,
种子 2018年12期
关键词:花粉管离体硼酸

,,,

(贵州省农业科学院茶叶研究所 贵阳 550006)

茶树(Camelliasinensis)为重要经济饮料作物,是世界3种无酒精饮料主要作物之一。茶树为雌雄同株且自交亲和性低的一种虫媒植物,由于茶树本身特性、开花季节、环境和花粉活力等因素的影响,茶树结实率往往较低[1],而较低的结实率会影响育种效率。福鼎大白茶(C.sinensiscv.Fuding-dabaicha)是国家级优良茶树品种之一,往往被作为杂交育种的优良亲本材料,目前利用福鼎大白茶作为亲本选育的优良品种有福云6号、福云7号、黔湄809、鄂茶1号等[2]。

花粉作为父本遗传信息传递的载体,是杂交育种实施的基本材料[3-4]。常规育种常会遇到气候不宜、不同品种花期不遇或雄性不育等问题[5]。因此,测定花粉活力,对于茶树杂交育种中的人工授粉、花期不遇的解决具有重要意义。

目前,对茶树花粉活力研究已有报道,如陈暄等[1]以龙井长叶花粉为材料,得到花粉最适的培养基为0.01%(100 mg/L)H3BO3+0.05%(500 mg/L)Ca(NO3)2+5%PEG-4 000+5%麦芽糖,25 ℃恒温培养1 h,萌发率为82.24%,花粉管生长长度为492μm;杨盛美等[6]以100 g/L蔗糖+1%琼脂的固体培养基,25 ℃恒温培养4 h,研究了10个茶种花粉的萌发率为9.2%~79.1%;许林等研究认为,台茶12号和福鼎大白茶的花粉离体萌发的最适培养基及条件是300 mg/L Ca(NO3)2+200 mg/L MgSO4+100 mg/L KNO3+100 mg/L H3BO3+10%蔗糖+1%琼脂,最适pH值为5.4,适宜萌发温度16~21 ℃培养24 h[7]。这些研究都是用离体萌发法测定花粉活力,因为品种不同,培养基组分差异等原因,所得结果则不尽相同。茶树花粉活力少见有染色法测定茶树花粉活力的报道。染色法是一种快速检测花粉活力的方法,为提高杂交育种结实率,杂交育种前对花粉活力的快速检测尤其重要。花粉离体萌发法是测定花粉活力最直观可靠的方法,本研究以福鼎大白茶花粉为材料,考虑不同浓度的蔗糖、硼酸、硝酸钙,采用正交试验设计优化茶树花粉离体萌发培养基;通过离体萌发法、TTC染色法的对比,探讨茶树花粉活力的快速测定方法。对茶树花粉的活力进行系统研究,以期建立有效、快速的花粉活力检测方法,为后期开展茶树花粉贮藏活力检测和杂交育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

以种植于贵州省农业科学院茶叶研究所茶树种质资源圃的5年生福鼎大白茶为研究对象,取其新鲜花粉作为试验材料。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

2017年11月,以福鼎大白茶花粉为材料,考虑不同浓度的蔗糖、硼酸、硝酸钙,采用正交试验设计优化茶树花粉离体萌发培养基;通过离体萌发法、TTC染色法的对比,探讨茶树(C.sinensis)花粉活力的快速测定方法。选择晴天09:00~11:00时,采集生长发育良好、含苞待放的花朵,及时摊放在阴凉干燥处,待24 h后花粉成熟时,轻轻打开花瓣,将花粉从花朵上轻轻抖落在硫酸纸上,除去杂质,放入棕色玻璃瓶中并充分振荡摇匀,用封口膜密封,贮藏于4 ℃冰箱备用。试验溶液均用蒸馏水配制,其浓度均为终浓度,配制溶液的pH值均为5.5±0.1,每处理均制作4个玻片,即4个重复。

试验一:花粉离体萌发法[8]

采用L9(34)正交试验筛选花粉离体萌发条件(表1),以期筛选出最优的离体萌发条件。

表1 茶树花粉离体萌发正交试验设计因素和水平

水平因素蔗糖(g/L)硼酸(mg/L)硝酸钙(mg/L)110010010021501501503200200200

试验二:氯化三苯基四氮唑(TTC)法[9]

采用2.5,5,10 g/L(m/v)3种浓度,以期筛选出最优的TTC染色法。

1.2.2 培养方法

试验一采用凹槽载玻片,不需加盖盖玻片。试验二使用的是光片载玻片,且制片时需要加盖盖玻片。往载玻片滴一小滴配制溶液,用牙签挑取少许花粉,轻拍手腕,将花粉抖落于培养基表面,当其表面呈微黄色即可。将制好的玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中,然后置于25 ℃恒温培养箱中培养。

1.2.3 观 测

试验一:培养24 h后用显微镜(尼康 Nikon ECLIPSE 80 i,日本生产,下同)观察花粉萌发情况,放大倍数为100倍,每个载玻片随机选取5个视野(每个视野花粉在100粒以上),统计每个视野花粉粒总数和萌发的花粉数,花粉萌发以花粉管长度大于花粉直径为标准;每个视野随机抽取10粒已萌发的花粉,测定花粉管长度。试验二:每隔30 min用显微镜观察花粉活力,放大倍数为100倍,每个载玻片随机选取5个视野(每个视野花粉在100粒以上),染为红色的花粉活力强,淡红色的次之,无色者为没有活力的花粉或不育花粉。预试验观察发现,2 h后染为红色和淡红色的花粉数量基本稳定,则试验2 h后停止观察,统计时将染为红色和淡红色的花粉计为有活力花粉。

1.3 数据处理

计算每个视野有活力的花粉粒数占总花粉粒数的百分率,花粉活力均用百分数表示,进而求算每个重复的平均值。用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析;对百分数类型数据转换为反正弦数据再进行分析。

2 结果与分析

2.1 花粉离体培养法最优培养基筛选

2.1.1 3个因素对花粉萌发率的影响

采用L9(34)正交试验通过花粉离体萌发测定花粉萌发率,由表2可知,蔗糖不同浓度对花粉离体萌发率影响较少,最佳的浓度为150 g/L的蔗糖;而硼酸和硝酸钙对花粉萌发率的影响显著(p<0.05),硼酸的最优浓度为第二水平(150 mg/L),其次是第一水平(100 mg/L),但两者差异不显著,而硝酸钙的第一水平和第二水平浓度的差异也不明显,对花粉萌发率影响最好的是第一水平(100 mg/L)。因此,就花粉萌发率而言,3个因素的最优组合是A2B2C1。

表2 3个因素的不同水平对花粉离体萌发率的影响

水平因素蔗糖(A)硼酸(B)硝酸钙(C)180.5683.48A86.35A284.2186.11A83.62A380.775.88B75.5B

注:同列数值不同大、小写字母分别表示差异极显著(p<0.01)和差异显著(p<0.05)。下同。

2.1.2 3个因素对花粉管生长长度的影响

蔗糖、硼酸、硝酸钙3个因素不同水平对花粉管生长长度的影响较大,蔗糖的不同浓度间对花粉管生长长度影响显著(p<0.05),最优水平是A2,其次是A1,两者差异不显著;而硼酸和硝酸钙不同浓度的影响达到了极显著水平(p<0.01)(见表3),硝酸钙的C1、C2水平与C3水平差异极显著,最优水平是C1,硼酸的B1、B2、B33个水平两两之间差异都达到了极显著水平,其中最佳的是B1,说明硼酸对花粉管长度影响起主要作用。如表3所示,最优组合是A2B1C1。

表3 3个因素的不同水平对花粉管生长长度的影响

水平因素蔗糖(A)硼酸(B)硝酸钙(C)1249.21ab375.62A278.04A2267.79a225.78B258.55A3216.93b132.53C197.35B

2.1.3 3个因素对花粉管长度的影响

由表4可知,蔗糖、硝酸钙对最长花粉管长度的影响为显著差异,而硼酸的影响为极显著差异,但3个因素的最优水平都是水平1,则最优组合是A1B1C1。A1与A2、C1与C2之间差异不显著,但分别与A3、C3达到极显著差异,而硼酸的3个水平间彼此差异极显著。

表4 3种因素的不同水平对最长花粉管长度的影响

水平因素蔗糖(A)硼酸(B)硝酸钙(C)1547.8a765.44A563.6a 2533.19a450.82B507.24a 3414.87b279.59C425.01b

2.1.4 优化水平组合的确定

综合3个测定指标的分析结果,且花粉萌发率是花粉萌发效果的主要指标。蔗糖、硼酸、硝酸钙3个因素中,硼酸对花粉萌发率、花粉管生长长度、最长花粉管长度的影响结果均达到了极显著水平;而硝酸钙对花粉萌发率、花粉管生长长度的影响达到极显著水平,对最长花粉管长度的影响达到显著水平;而蔗糖对花粉萌发率影响不显著,对花粉管长度和最长花粉管长度差异影响显著。因此,3个因素对茶树花粉体外萌发效果的影响排序为B(硼酸)>C(硝酸钙)>A(蔗糖),最优水平组合为A2B2C1,即150 g/L蔗糖+150 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸钙,其次是100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸钙,3种方法比较时用100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸钙。

2.2 TTC法对花粉活力检测

在TTC染色法试验中,随着TTC的浓度增加,被染为红色和淡红色的花粉粒增加,其中10 g/L TTC的着色花粉粒最多,达83.17%(1 h时)。除了2.5 g/L TTC和5 g/L TTC随着培养时间增加而着色花粉粒增加,2.5 g/L TTC在0.5 h的着色花粉粒与1,1.5,2 h的着色花粉粒有显著差异,而5 g/L TTC和10 g/L TTC在4个时间段的着色花粉数差异不显著,且10 g/L TTC染色受时间的影响较小,1 h的着色花粉粒最多为83.17%,1.5 h和2 h的着色花粉数却较1 h的少。TTC这种现象可能说明在2.5 g/L TTC和5 g/LTTC时,TTC底物不能满足氧化还原反应,随着时间的增加,更多的TTC被还原为TTF,则着色花粉粒增多;而在10 g/L TTC时,TTC底物充足,在短暂的时间内,过量的TTC即可通过花粉的呼吸作用的氢还原为TTF,因此,4个时间段着色花粉数差异不显著,且与花粉离体萌发法结果相近,说明用10 g/L TTC染色法快速检测花粉活力效果最佳,且该浓度染色时间以1 h即可(图1)。

注:不同大写字母表示同一时间不同浓度间差异极显著(p<0.01),不同小写字母表示同一浓度不同时间差异显著(p<0.05)。图1 不同TTC浓度对茶树花粉活力的影响

注:a为花粉离体培养液1培养生长情况,放大100倍;b为10 g/L TTC法30 min染色情况,放大100倍。图2 不同方法的茶树花粉活力测定比较

2.3 花粉活力检测方法比较

如图2所示,利用显微镜观察,10 g/L TTC法对茶树花粉的染色效果明显,视野内可清晰区分出花粉的红色、淡红色以及未着色花粉;花粉离体萌发法培养花粉,在显微镜下可明显区分出萌发花粉粒,是一种直观可靠的方法。

如表5所示,离体萌发法(100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸钙)的测定结果最高,为90.04%, TTC法染色为83.17%。2种方法测定的花粉活力差异不显著(p>0.05),因离体萌发法和TTC法统计时易分辨,且重复性好,则可用这2种方法测定茶树花粉活力(表5),且TTC法可用于快速检测茶树花粉活力。

表5 2种方法测定茶树花粉活力比较

方法花粉活力(%)花粉离体萌发90.04aTTC法83.17a

3 讨 论

花粉离体萌发和花粉管的生长,需要适当的硼酸和钙离子。有研究认为,硼酸可以促进花粉对蔗糖的吸收和代谢,从而促进花粉萌发。适宜的外源硼酸浓度可促进花粉萌发和花粉管生长[10-11]。钙离子的动态变化对花粉萌发启动、花粉管的生长调节具有重要作用[12],花粉是否正常萌发和花粉管是否正常伸长,直接影响植物的受精作用。外源钙离子可促进花粉管伸长,即花粉管在花柱中快速生长,缩短授粉时间。Wang 等认为,外源钙离子可以代替花粉萌发时的群体效应,因此,花粉离体萌发时,适宜浓度的钙离子能促进花粉萌发[13]。本研究结果表明,适当浓度的硼酸和钙离子对于茶树的离体萌发和花粉管生长均具有明显的促进作用。蔗糖在花粉离体培养时,常作为基本培养基,除了为花粉萌发提供营养,还可以调节花粉的渗透压。本研究发现,适合茶树最优的花粉离体培养的最优蔗糖浓度为150 g/L,与西南桦(Betulaalnoides)[14]、核桃[15-16]、曼地亚红豆杉(Taxusmedia‘Hicksii’)[8]、肉果秤锤树[17]所需的蔗糖浓度一致。说明150 g/L蔗糖浓度对于多数不同种类植物的花粉离体萌发比较适合。许林等研究表明,福鼎大白茶和台茶12号花粉离体萌发的最适培养基为:10%(100 g/L)蔗糖+100 mg/L硼酸,花粉萌发率分别为54.09%和64.02%[7];而本研究用培养基为100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸钙,其花粉萌发率为90.04%,这种差异可能是在培养基中添加了硝酸钙,促进了花粉的萌发。

花粉活力的快速测定,是保证后续育种工作顺利进行的前提。用染色法测定花粉活力,具有简便、快速的优点,通常被用于快速检测花粉活力[18]。TTC染色法原理是花粉萌发过程中由脱氢酶引起的氧化还原反应,将无色的TTC发生还原反应,生成红色的三苯甲腙则有活力花粉被染成红色,无活力花粉不显色。5 g/L TTC可用于检测曼地亚红豆杉[8]和大豆[19]的花粉活力,而本研究结果以10 g/L TTC浓度的染色效果最好,这可能是因为不同物种花粉的差异导致。

有学者研究表明,福鼎大白茶的花粉萌发率可达到90%以上[2]。本研究的花粉活力测定方法结果与其相近,说明本试验的花粉活力测定结果可靠。采用2种检测方法的结果差异不显著,则花粉离体萌发法和TTC法都可以用于检测茶树花粉活力,TTC法具有快速、易分辨、稳定性好等优点,且与花粉离体萌发结果相近,因此,10 g/L TTC可用于快速检测茶树花粉活力。

4 结 论

硼酸和硝酸钙对于茶树花粉离体萌发和花粉管的伸长和生长有显著的促进作用,最适的茶树离体萌发培养基是150 g/L蔗糖+150 mg/L硼酸+100 mg/L。本研究通过比较花粉离体萌发法与TTC染色法检测茶树花粉活力,结果表明,适合茶树花粉活力测定的方法为花粉离体萌发法和TTC染色法,但TTC法具有快速、易分辨、稳定性好等优点,可用于茶树花粉活力的快速测定,其最佳TTC浓度为10 g/L。

猜你喜欢
花粉管离体硼酸
Nadorcott 柑桔无核化处理对组培花粉管生长的影响
酯化法高纯硼酸制备中痕量钙残存机理及脱除方法探究
硼酸对分光光度法测量溶硅的影响
细胞质膜AHAs维持花粉管的生长和受精(2020.5.20 Plant Biotechnology Journal)
元胡止痛口服液对缩宫素致小鼠离体子宫痉挛性收缩的影响
外源性硼酸在大豆制品
——腐竹中的形态研究
取代硼酸与羟乙基胺化合物间的相互作用研究
重金属对梨花粉萌发及生长有影响
灵魂离体
对萼猕猴桃无菌离体再生体系研究