1-甲基环丙烯和乙烯吸收剂结合冰温贮藏对山楂果实品质的影响

王 亮，张新宪，赵迎丽，张立新，王春生

（山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所，山西 太原 030031）

山楂（Crataegus pinnatifida）属于山楂属（Crataegus L.），是一种经济和营养价值较高的仁果类药食兼备的上等补品[1]。近年来，随着山楂产业的迅猛发展，无论是鲜食还是作为原料果，均对山楂的品质提出了更高的要求；然而实际生产中多以窑洞和普通商业冷库为代表的传统贮藏方式为主，由于贮藏设施与技术发展的相对滞后，不能从根本上解决山楂果实软化、褐变乃至品质劣变等主要问题，导致山楂在贮藏过程中的品质和商品价值大幅降低，严重制约着山楂产业的发展；因此寻找一种新的山楂贮藏保鲜方法至关重要。

冰温贮藏是近年来兴起的保鲜新技术，冰温是指冰点以上、0 ℃以下的温度区域，是机体冻结前的最低温度带，在该温度区域下可使机体的生理活性降到最低程度，又能维持其正常的新陈代谢[2]，并可显著抑制贮藏过程中微生物生长、脂肪氧化及蛋白质降解[3]。冰温贮藏技术在‘红富士’苹果[4]、库尔勒香梨[5]、‘玫瑰香’葡萄[6]、樱桃[7]、猕猴桃[8]等水果的贮藏中效果良好。1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）是一种新型乙烯受体抑制剂，在低浓度下可抑制乙烯生成，且在处理后的水果中未检测到其残留[9]，已经在生产上得到较为广泛的应用。近年来研究人员对‘金冠’苹果[10]、‘黄冠’梨[11]、酥梨[12]、蓝莓[13]、猕猴桃[14]等多种水果进行采后1-MCP处理研究；在乙烯吸收剂（ethylene absorbent，EA）应用方面，Wang Siyao等[15]研究发现EA处理可抑制在0 ℃冷藏和货架期蓝莓果实的软化，贮藏期可达30 d。但目前有关冰温条件下比较1-MCP和EA二者对果实品质影响的研究鲜有报道。

课题组在之前的研究中发现-1 ℃冰温条件下结合0.02 mm微孔保鲜袋贮藏对山楂有较好的保鲜效果[16]。本研究在山楂果实冰温贮藏基础上，结合目前生产上广泛使用的1-MCP乙烯受体阻断剂和传统EA 2 种乙烯抑制处理方式，进行贮藏效果比较，通过对山楂果实冰温贮藏期间生理品质指标以及组织微观结构进行测定和比较分析，最终筛选出冰温贮藏条件下更适合山楂果实的乙烯抑制处理方式及使用剂量，希望能够有效延缓果实软化与衰老，降低生理伤害，实现延长果实贮藏与货架寿命的目的，以期助力山楂产业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘敞口’山楂于2015年9月21日采于山西省晋中市祁县东观乡官厂村，选择栽培管理规范、果实发育正常、病虫害少的果园，采前10 d停止浇水，且采摘当日无雨，采摘后当天使用低温冷藏车（（5.0±0.5）℃）运回山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所，挑选果型大小基本一致、无病虫害、无机械伤、表面完全转红的八成熟果实为试材，果肉初始硬度为27.3 kg/cm2。

聚乙烯微孔保鲜袋（厚0.02 mm，规格为65 cm×70 cm的桶状） 山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所；1-MCP（粉剂，质量分数为0.14%） 美国罗门哈斯公司；EA（商品名为“高效乙烯去除剂”，高锰酸钾纯度10%，每袋10 g） 山西龙田保鲜技术开发有限公司；所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

冰温保鲜库 山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所；Ultrospec 2000紫外-可见分光光度计 英国Pharmacia Biotech公司；PR-101α折光仪 日本ATAGO（爱拓）中国分公司；GXH-3051H果蔬呼吸测定仪北京均方理化科技研究所；GC-14C气相色谱仪 日本岛津公司；FT011硬度计 意大利TR公司。

1.3 方法

1.3.1 处理方法

实验分为普通冷藏组、冰温贮藏组（冰温贮藏对照组和4 个冰温贮藏处理组），其中冰温贮藏处理组包括0.5 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组、1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组、1 袋EA+冰温贮藏处理组、2 袋EA+冰温贮藏处理组，经处理后的果实均在冰温贮藏条件下进行贮藏。

普通冷藏组和冰温贮藏对照组：将山楂果实在冷库预冷至0～1 ℃，每10 kg山楂果装入衬有微孔保鲜袋的塑料周转箱中预冷后，扎严袋口，普通冷藏组果实直接于（0.0±0.5）℃条件下贮藏；冰温贮藏对照组果实在将山楂果实在冷库预冷至0～1 ℃后，移入冰温库，库温稳定至0 ℃后，每3 d下调库温0.1 ℃，当果实温度稳定在-1.0 ℃时，进行长期贮藏。

1-MCP+冰温贮藏处理组：将山楂果实置于透气塑料周转箱中，放于密闭箱体，20 ℃下在密闭箱体中分别使用0.5、1.0 μL/L 1-MCP对山楂果实熏蒸24 h，预冷至0～1℃后，每10 kg山楂果装入衬有微孔保鲜袋的塑料周转箱中，扎严袋口，再冰温贮藏（操作与冰温贮藏对照组处理一致）。

EA+冰温贮藏处理组：将山楂果实预冷至0～1 ℃，每10 kg山楂果装入衬有微孔保鲜袋的塑料周转箱中，分别放入1袋和2袋EA后扎严袋口，再冰温贮藏（操作与冰温贮藏对照组处理一致）。

贮藏期间每30 d测定果实乙烯释放量、呼吸强度、果肉硬度；每90 d测定果实中原果胶、可溶性果胶质量分数及黄酮类化合物、果皮花青素含量；在贮藏270 d时测定可溶性固形物、可滴定酸质量分数及质量损失率、褐变率和好果率，并对果皮、果肉显微组织结构进行电子显微镜观察。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 乙烯释放速率、呼吸强度的测定

采用气相色谱法测定乙烯释放速率。每次将1 kg样品置于真空干燥器内，密闭2 h后使用注射器抽取干燥器中的气体20 mL，用GC-14C气相色谱仪（配备氢火焰离子化检测器）测定乙烯含量。采用面积外标法计算果实乙烯释放速率，标准样品的含量为50 μL/L。使用果蔬呼吸测定仪测定呼吸强度，单位为mg/（kg·h）。

1.3.2.2 硬度的测定

在每个果实中间最大横径处去皮，取4 个点采用硬度计测定硬度，为避免探头与种子接触，探头打入果肉至硬度计的1/2进果线处，单位为kg/cm2[17]。

1.3.2.3 原果胶和可溶性果胶质量分数的测定

原果胶和可溶性果胶质量分数的测定均采用咔唑比色法[18]。

1.3.2.4 黄酮类化合物含量的测定

采用盐酸乙醇法测定黄酮类化合物含量[19]，取2 g果肉鲜样匀浆后，用提取液（V（体积分数95%乙醇）∶V（1.5 mol/L盐酸）＝85∶15）定容至25 mL，暗处常温下浸提24 h，使用紫外-可见分光光度计在325 nm波长处测定吸光度，以每克鲜质量果肉吸光度（A325nm）表征黄酮类化合物含量。

1.3.2.5 果皮花青素含量的测定

取2 g果皮，使用FT011硬度计所带削皮刀取样，保证取样厚度一致，用体积分数1%盐酸-甲醇溶液研磨后定容至25 mL，室温暗处浸提24 h，常温下4 000 r/min离心5 min，取上清液，使用紫外-可见分光光度计在波长530 nm和600 nm处测定吸光度，花青素含量由每克果皮组织在这2 个波长处吸光度的差（A530nm-A600nm）表示[19]。

1.3.2.6 可溶性固形物、可滴定酸质量分数的测定

将山楂果肉与蒸馏水以质量比1∶4，在组织捣碎机中打成匀浆，并将匀浆用滤纸进行过滤后，采用折光仪进行测定，测定结果的5 倍即为山楂果实的可溶性固形物质量分数。

采用酸碱滴定法测定可滴定酸质量分数[20]，取10 g山楂果肉匀浆，蒸馏水定容至100 mL，取10 mL滤液，用0.1 mol/L NaOH溶液进行滴定（酚酞为指示液）。

1.3.2.7 果肉褐变率、质量损失率、好果率的测定

在各处理中取样2 kg进行解剖，统计横剖面褐变的果实个数，按公式（1）计算果实褐变率，并按公式（2）、（3）分别计算果实的质量损失率和好果率，以发生褐变、腐烂和硬度过低（果肉硬度≤10kg/cm2）的果实定义为失去商品性的果实。

1.3.2.8 果皮、果肉微观结构观察

将不同处理组的山楂分别切取厚度为2 mm左右的外皮层和果肉，将取下的样品迅速放到体积分数3%戊二醛固定液（0.1 mol/L、pH 7.2磷酸盐缓冲液配制）中，然后4 ℃固定6 h。用相应的缓冲液洗涤3 次，每次15 min，体积分数30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液逐级脱水，每级15 min，无水乙醇脱水2 次，每次20 min，然后叔丁醇置换，用JEOL JFD-320冷冻干燥仪进行冷冻干燥，把干燥后的材料用导电胶带粘在样品台上，用JEOL JFC-1600离子溅射镀膜仪喷镀铂金，喷镀好的材料放入扫描电子显微镜下进行形态观察。

1.4 数据统计分析

实验数据使用SPSS 20.0软件的Duncan法进行显著性分析，采用Excel 2007软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对山楂果实贮藏过程中乙烯释放速率及呼吸强度的影响

图1 不同处理对山楂果实贮藏过程中乙烯释放速率（A）及呼吸强度（B）的影响Fig.1 Effects of different treatments on ethylene production rate (A)and respiration intensity (B) of hawthorn fruits during storage

果实乙烯释放速率与呼吸强度是反映果实采后生理代谢水平的重要指标。如图1A所示，在0～120 d各处理组山楂果实乙烯释放速率始终处于较低水平，在150 d后呈先升高后降低趋势。在贮藏210 d时，1.0 μL/L 1-MCP处理组出现高峰，值为3.85 μL/（kg·h），低于其他处理组峰值；而其他处理组乙烯释放速率峰值均在贮藏180 d时出现，其中普通冷藏处理组峰值最高，为6.85 μL/（kg·h）。说明1.0 μL/L 1-MCP处理+冰温贮藏不仅降低了贮藏过程中果实的乙烯释放速率，还推后了乙烯释放速率峰值的出现。由图1B可知，0～150 d各处理组中山楂果实呼吸强度在贮藏初期下降后，30～150 d期间一直处于较低水平；除1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组果实呼吸高峰在210 d出现外，其余处理组呼吸高峰均在180 d出现。说明1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏较其他处理可明显抑制山楂果实的呼吸代谢速率，并推迟呼吸高峰的出现，延缓山楂果实的衰老进程。此外，各冰温贮藏组中山楂果实呼吸代谢速率始终低于普通冷藏组，说明冰温处理能降低果实呼吸代谢速率。

2.2 不同处理对山楂贮藏过程中果肉硬度的影响

图2 不同处理对山楂贮藏过程中果肉硬度的影响Fig.2 Effect of different treatments on flesh firmness of hawthorn fruits during storage

如图2所示，山楂果肉硬度在贮藏期间总体呈下降趋势，冰温贮藏各处理组中山楂果肉硬度下降速率相对普通冷藏组均被明显抑制，其中1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组果实果肉硬度下降最为缓慢，贮藏270 d时，果肉硬度仍能维持在14.50 kg/cm2，高于其他处理组。2 袋EA+冰温贮藏处理组果肉硬度仅次于1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组，270 d后果肉硬度为11.30 kg/cm2。通过2 种抑制乙烯生成的方式比较，可以看出，在贮藏前150 d，1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组与2 袋EA+冰温贮藏处理组对维持果实硬度效果差异不明显，但在贮藏后期1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理比2 袋EA+冰温贮藏处理效果持续性较好，这可能与1-MCP和EA对乙烯抑制作用机理不同有关。

2.3 不同处理对山楂贮藏过程中果肉中果胶质量分数的影响

图3 不同处理对山楂贮藏过程中原果胶（A）和可溶性果胶（B）质量分数的影响Fig.3 Effect of different treatments on protopectin (A) and soluble pectin (B) contents in hawthorn fruits during storage

在整个贮藏过程中，原果胶质量分数呈现下降趋势（图3A），而可溶性果胶质量分数逐渐上升（图3B），且各处理组中山楂果实原果胶质量分数与可溶性果胶质量分数呈负相关关系；说明随山楂果肉硬度的下降，原果胶被降解生成可溶性果胶。贮藏270 d时，与其他处理组相比，普通冷藏组原果胶质量分数下降和可溶性果胶质量分数上升速率更快，说明相比普通冷藏，冰温贮藏可明显抑制原果胶向可溶性果胶转化的速率。本研究中，冰温结合经乙烯抑制处理效果明显好于单独使用冰温贮藏，且在贮藏前180 d，1-MCP、EA处理组之间原果胶和可溶性果胶质量分数差异不显著（P＞0.05）；贮藏270 d时，1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组中的原果胶质量分数显著高于2 袋EA+冰温贮藏处理组，而可溶性果胶质量分数则低于2 袋EA+冰温贮藏处理组（P＜0.05），说明1.0 μL/L 1-MCP处理抑制冰温贮藏的山楂果实中原果胶向可溶性果胶转化效果更加显著，可有效减缓山楂果肉硬度的下降速率，保持良好的贮藏品质。

2.4 不同处理对山楂贮藏过程中果肉黄酮类化合物和果皮花青素含量的影响

图4 不同处理对山楂贮藏过程中黄酮类化合物（A）和果皮花青素（B）含量的影响Fig.4 Effect of different treatments on flavonoid (A) and anthocyanin of peel (B) contents in hawthorn fruits during storage

黄酮类化合物与果皮花青素是山楂果实中的重要生物活性物质，含量高低直接反映山楂贮藏品质的优劣。如图4A所示，在贮藏过程中山楂果实中黄酮类化合物含量呈先升后降的趋势，这可能是山楂果实后熟作用的结果。其中普通冷藏组、冰温贮藏对照组和0.5 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组果实的黄酮类化合物含量在贮藏90 d时达到最大值；而1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组、1 袋EA+冰温贮藏处理组、2 袋EA+冰温贮藏处理组在贮藏180 d达到最大值。其中贮藏270 d时，1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组山楂果实黄酮类化合物的含量显著高于其他处理组（P＜0.05），说明1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理有效减缓了山楂果肉中黄酮类化合物的降解速率。

由图4B可知，在贮藏过程中，不同处理组中山楂果皮花青素含量呈逐渐上升趋势，可见山楂果实中的花青素含量也可作为判断山楂果实成熟衰老的指标之一。其中1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组山楂果皮花青素含量始终低于普通冷藏和其他冰温贮藏组，说明该处理可有效抑制山楂果实因成熟衰老引起的花青素积累。

2.5 不同处理对山楂果实贮藏品质的影响

表1 贮藏结束时不同处理中山楂果实的品质指标Table1 Quality indices of hawthorn fruits subjected to different treatments after storage%

经测定，山楂果实的初始可溶性固形物质量分数和可滴定酸质量分数分别为16.20%、2.89%（表中未列出）。如表1所示，与贮藏前相比，贮藏270 d后果实可溶性固形物、可滴定酸质量分数以及好果率均下降，而质量损失率和褐变率则上升。其中1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组的山楂果实在贮藏270 d时，可溶性固形物质量分数、可滴定酸质量分数和好果率均高于普通冷藏及其他冰温贮藏组，而质量损失率和褐变率均低于普通冷藏与其他冰温贮藏组。

图5 贮藏结束后不同处理组山楂的果肉表观色泽Fig.5 Flesh color of hawthorn fruits with different treatments at the end of storage

由图5可看出，不同处理中山楂果肉色泽存在差异，其中冰温条件下结合使用1-MCP和EA处理可有效抑制果肉色泽褐变，有利于山楂果实贮藏品质提升。通过肉眼观察，各处理组山楂果肉褐变程度从高到低排序为：普通冷藏＞1 袋EA+冰温贮藏＞2 袋EA+冰温贮藏＞0.5 μL/L 1-MCP+冰温贮藏＞1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏。可直观看出1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理抑制果肉褐变效果更佳。

2.6 不同处理对山楂果皮和果肉微观结构的影响

图6 贮藏前后山楂果实的表皮组织结构Fig.6 Epidermal tissue of hawthorn fruits before and after storage

图7 贮藏前后山楂果实果肉组织结构Fig.7 Flesh tissue of hawthorn fruits before and after storage

植物细胞的细胞壁与细胞的生长、发育、分化以及物质代谢密切相关，它既构成细胞结构骨架，同时还参与细胞大部分的生理活动。相关研究表明，细胞壁胞间层结构的改变会导致细胞壁物质降解、细胞分离，进而破坏细胞壁总体结构而引发果实变软。由图6A1、B1可以看出，采摘预冷后的新鲜山楂，果皮平滑，果点边缘规则；而经过270 d贮藏后，普通冷藏组（图6A2、B2）果实表皮出现褶皱起伏，果点边缘开裂严重，说明果实失水较为严重；由图7A1、B1看出，采摘预冷后的新鲜山楂果肉组织结构整齐、规则、致密，反映出较好的新鲜度。而普通冷藏组（图7A2、B2）山楂果肉组织结构松散，细胞壁结构出现许多不规则空腔和孔洞，组织结构均匀性差；这可能是贮藏期间果实自身衰老和组成结构物质消耗导致微观形态的改变，从另一方面印证了果肉硬度、果实新鲜度下降的原因。

由图6A3、B3和图7A3、B3可知，1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组的山楂果实在贮藏结束后，表皮未出现褶皱，果实表皮果点相对采收时边缘略有开裂，相对普通冷藏组，果肉组织所出现的空腔孔洞相对较少，结构变化较小；说明1-MCP处理结合冰温贮藏有效抑制了山楂果实失水以及果肉组织内有关结构物质的降解，较好地保持了山楂果实质地。

3 讨 论

从果实的呼吸强度和乙烯释放速率的趋势变化可以看出，‘敞口’山楂属典型的呼吸跃变型果实；1-MCP已被证明对呼吸跃变型果实比较有效[21]。本研究发现，-1.0 ℃的冰温条件下，1-MCP和EA处理对‘敞口’山楂果实呼吸代谢、果肉软化均有抑制作用，比单独使用冰温贮藏方式效果更佳；说明冰温贮藏与1-MCP、EA结合使用产生保鲜效果的协同效应。Bai Xiaohang等[22]发现促进保鲜配方和1-MCP的联合处理比单独使用1-MCP更有利于延缓甜瓜成熟和衰老，保持果实品质，延长保质期，提高芳香挥发性化合物的水平；Lu Xingang等[23]发现1-MCP与Ca处理相结合，对‘红富士’苹果果实的香气形成和软化抑制具有协同作用，从而能提高其感官品质。在本研究中，1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理的保鲜效果显著优于其他处理，不仅降低了呼吸强度和乙烯释放速率高峰值，还能推迟其出现。1-MCP与EA的抑制乙烯作用机理不同，1-MCP是通过与乙烯竞争受体，并与之紧密结合，阻断乙烯与受体的正常结合，从而有效地阻止内源乙烯的合成和外源乙烯的诱导作用，主要是通过抑制果实乙烯生成系统II的乙烯合成来实现的[24]，该作用一旦起效后，即使解除外界1-MCP气体环境，其抑制乙烯效果仍然持续稳定；而乙烯吸收剂是通过化学氧化反应来吸收果实自身产生的乙烯气体，从而降低贮藏环境中乙烯的含量，达到抑制果实代谢速率的目的；在使用过程中，随着反应的进行有效成分不断减少，吸收和氧化能力不断衰减，进而导致贮藏后期的乙烯抑制效果不佳的情况发生。

贮藏期间果实中黄酮类化合物含量呈先升后降趋势，而果皮花青素含量则随果实后熟衰老逐渐增加，其中1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理较其他处理可明显抑制果实中黄酮类化合物的减少以及果皮花青素含量的上升，表现出较好的保鲜效果。在Park等[25]对EA和1-MCP对番茄影响的研究中，2 μL/L 1-MCP比1 μL/L 1-MCP的处理对推迟番茄果实转红更有效，EA处理不及2 μL/L 1-MCP处理保鲜效果显著，与本研究中1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理能有效抑制山楂果皮中花青素含量的上升，EA不及1-MCP（1.0 μL/L）处理效果明显的研究结果相似。此外，随着贮藏时间的延长，各处理组果肉硬度下降，原果胶降解转化为可溶性果胶，山楂果肉硬度与果实中原果胶含量呈正相关，而与可溶性果胶含量呈负相关关系，结合果皮与果肉显微组织结构出现空腔与空洞的变化情况，从另一方面阐述了1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理能更有效抑制果肉软化的机理；这与使用1-MCP处理甜瓜[26]、番木瓜[27]、苹果[28]和‘巴特利特’梨[29]等研究结果相一致。可见1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理可以有效抑制山楂果实采后软化现象的发生，并较好地维持果实组织的新鲜质地。

研究发现，果实衰老和环境胁迫造成的生理性伤害是造成采后山楂果肉褐变的主要因素[16]。在本研究中山楂果实在冰温的低温胁迫条件下，并未造成山楂果实生理伤害导致的褐变率上升。1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理组山楂果实的褐变率最低，仅为3.05%，说明该处理对抑制山楂果肉褐变效果非常显著，这与Chen Yuan等[30]发现1-MCP在非生物胁迫条件下，可有效延缓棉花植株叶片衰老的研究结果相似。进一步说明，1.0 μL/L 1-MCP+冰温贮藏处理是延缓贮藏期间山楂果肉褐变切实可行的保鲜方式。

4 结 论

1.0 μL/L 1-MCP处理结合冰温贮藏能有效抑制山楂果实乙烯释放速率及呼吸强度，且推迟了二者峰值的出现；减缓了原果胶向可溶性果胶的转化速率，较好地维持了果肉硬度，并减缓了山楂果实失水以及果肉组织内有关结构物质的降解，较好地维持了山楂果实采后果肉质地与色泽；降低了果肉中黄酮类化合物降解和果皮花色苷含量上升速率；有效抑制了果实中可溶性固形物和可滴定酸的损失，减小了果实质量损失率和褐变率，较好地维持了山楂果实良好的贮藏品质。可见，1.0 μL/L 1-MCP处理结合-1.0 ℃冰温贮藏是‘敞口’山楂长期高品质贮藏的综合保鲜技术。