抗纤灵方对阿霉素肾病大鼠肾纤维化指标的影响

蒋宇峰，朱尧焓，陈 潇，何立群

（1.上海中医药大学附属曙光医院西院，上海 200021；2.上海中医药大学肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海 201203）

慢性肾功能衰竭（CRF）是多种慢性进行性肾脏疾病进展至终末期最终结果。其发病的重要病理基础就是肾脏纤维化表现，是各类肾脏疾病最后共同病理改变，包括肾小球硬化和肾间质纤维化[1-3]。我院传统中药制剂抗纤灵颗粒，经前期20余年临床和实验发现，其具有保护肾功能，降低蛋白尿作用[4-5]。本研究通过肾切除联合阿霉素诱导大鼠建立肾纤维模型，在肾功能、尿蛋白定量、细胞因子及肾脏病理组织形态多方面研究抗纤灵方治疗肾脏纤维化的作用。

1 材料

1.1 动物 实验动物均有由上海中医药大学实验动物中心提供，雄性SD大鼠40只，体质量（180±20）g，清洁级。所有大鼠均在上海中医药大学实验动物中心统一管理，分笼SPF级喂养，自由饮水，用标准普通饲料喂养。需适应性喂养1周，环境为45 %湿度，温度25 ℃。

1.2 实验药物制备 抗纤灵方由丹参15 g，制大黄15 g，黄芪15 g，牛膝15 g，桃仁15 g，仙灵脾15 g组成。从曙光医院西院中药房购买上述药材，按成人60 kg标准剂量20倍，用量为30 g/（kg·d）灌注药物2 mL/d，抗纤灵配成为含原药3.0 g/mL的药液。科素亚0.1 g/片，默沙东公司提供，灌胃前用蒸馏水配制成混悬液，用量为33 mg/（kg·d）灌注药物2 mL/d。

1.3 试剂与仪器 肾功能检测血清肌酐、尿素氮和尿蛋白定量，其试剂盒购自南京建成生物工程研究所，曙光医院中心实验室全自动生化分析分析仪测定肾功能（Bun、Cr），免疫比浊法测定24 h尿蛋白总量。Trizol Reagent RNA抽提试剂盒（Invitrogen）；荧光定量PCR试剂盒 购自BioTNT公司；由CST公司提供兔抗小鼠TGF-β一抗，由SANTA CRUZ公司提供兔抗小鼠CTGF一抗，上海威奥生物有限公司提供二抗山羊抗兔。

2 方法

2.1 造模及分组方法 取正常对照组8只大鼠予以生理盐水灌胃，不做任何处理，作对照组；余下32只大鼠于配置好3%戊巴比妥钠按照1.5 mL/kg腹腔注射麻醉，采用8只大鼠只切除右肾后，不注射阿霉素，作为假手术组后只予以生理盐水灌胃。另剩余24只大鼠均采用右肾摘除加重复注射阿霉素的肾纤维化动物模型。手术组按上述麻醉后，均于右肾肾门结扎，切除右肾。术后1周后手术组大鼠尾静脉给予注射阿霉素溶夜浓度3 mg/kg，常规喂养4周后，手术组再进行第2次尾静脉注射，阿霉素溶液浓度3 mg/kg。造模后2周眼球取血，根据血肌酐显著高于正常组验证模型成功，然后根据血肌酐值随机分为3组，包括模型组8只、抗纤灵组8只、科素亚对照组8只，使实验各组间大鼠血肌酐值无显著性差异，P＞0.05。

2.2 药物干预及标本采集 固定动物饲料和生理盐水分别喂以正常组、假手术组、模型组。抗纤灵组以成人剂量/kg体质量的20倍灌胃，每日灌胃1次，科素亚组以成人剂量/kg体质量的20倍灌胃，每日灌胃1次，连续8周后处死。手术处死前1天用代谢笼收集各组大鼠24 h尿量。按上述方法常规腹腔麻醉后，先腹主动脉采血3～5 mL后，再结扎左肾门，切除左肾，洗净附着血液后，放入液氮保存组织标本。抽取血液以2 000 rpm离心15 min后，取500 μL上层血清- 80 ℃保存，待今后检测相关指标。

2.3 观察指标

2.3.1 每日观察大鼠生活情况 观察大鼠精神状态，活动饮食情况变化，外观皮毛亮泽、大便性状、体质改变等表现。

2.3.2 肾功能测定 离心血清肌酐值用苦味酸法，尿素氮值用二乙酰-肟比色法，24 h尿蛋白定量值采用免疫比浊法测定。

2.3.3 肾 组 织 TGF-β、CTGF mRNA RT-qPCR 测 定表达 取大鼠肾组织，用Trizol 总试剂盒提取组织RNA，逆转录合成cDNA模板，进行PCR扩增，扩增体系如下：大鼠TGF-β，CTGF及GAPDH引物序列由invitrogen 公司合成，按操作说明反应条件95 ℃，5 min预变性；95 ℃，5 s变性，60 ℃退火30 s，40次循环，进行数据实时扩增曲线和熔解曲线。所得Ct值以2-△△Ct计算mRNA的相对表达量。

2.3.4 肾组织病理变化观察 大鼠左肾组织石蜡包埋，MASSON染色，显微镜检测，图像采集分析。

2.3.5 肾间质病理损害评价方法 分别采用6项病理指标来评价损害情况，1）肾小管扩张；2）肾小管萎缩；3）肾小管上皮细胞变性；4）肾小管上皮细胞坏死；5）肾间质纤维化；6）肾间质炎症细胞浸润。肾小管无病理变化，即没有肾小管扩张、萎缩、上皮细胞变性、坏死或无炎症，评0分；肾小管发生轻度改变占视野的20%，轻度1分；肾小管病变累及范围占视野的21%～40%，中度评2分；病变达到肾小管范围＞视野的40%，重度3分。该标本的肾小管间质损伤指数计算法以显微镜下随机选取10个视野，按上述标准计算评分后的平均值，作为肾小管间质损伤指数。

2.4 统计学方法 统计学分析采用SPSS 18.0软件进行，计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 一般情况观察 正常组、假手术组大鼠精神表现状态良好、自由活动、毛有亮泽，饮食正常、随时间增长体质量逐渐增加。尾静脉注射阿霉素后，模型组和科素亚组分别有1只死亡。模型组和各治疗组大鼠分别有精神不振、静止待坐、不思饮食、毛发无亮泽杂乱、体质量不增加或减轻和大便变稀等表现，其中以无治疗模型组症状较抗纤灵组、科素亚组上述症状重，而抗纤灵组大鼠变化相对情况轻。

3.2 各组大鼠24 h尿蛋白定量，血肌酐，尿素氮定量 见表1。与正常组、假手术组比较，模型组、抗纤灵组、科素亚组蛋白尿肌酐、尿素氮均有不同程度升高，以模型组改变最明显。抗纤灵和科素亚组治疗后，与模型组比较，各指标表达均有减低（P＜0.05），24 h尿蛋白定量抗纤灵组表达降低，与科素亚组比较有统计学差异（P＜0.05）。

表1 各组肾功能，尿蛋白结果比较（ ）

表1 各组肾功能，尿蛋白结果比较（ ）

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组组比较，△P＜0.05，与科素亚组比较，▲P＜0.05

组 别 n 24h尿蛋白定量/（mg/24 h） 血肌酐/（μmol/L） 血尿素氮/（mmol/ L）正常 8 15.32±2.04 65.21±4.38 8.12±4.29假手术 8 17.34±3.15 67.54±5.21 8.21±3.52模型 7 134.32±2.13# 182.31±4.67# 26.57±3.56#抗纤灵 8 43.32±4.01#△▲ 88.32±3.22#△ 15.42±5.02#△科素亚 7 65.32±3.61#△ 86.62±4.21#△ 18.53±4.31#△

3.3 各组大鼠肾组织TGF-β、CTGF mRNA水平比较 见表2。与模型组比较，抗纤灵组、科素亚组TGF-β、CTGF mRNA表达水平均有下降（P＜0.05），与科素亚组比较，TGF-β表达水平下降优于科素亚组，有统计学差异（P＜0.05）。

表2 各组大鼠肾组织 TGF-β、CTGF mRNA比较（ ）

表2 各组大鼠肾组织 TGF-β、CTGF mRNA比较（ ）

注：与模型组比较，# P＜0.05；与科素亚组比较，△P＜0.05

组 别 n TGF-β CTGF假手术 8 0.54±0.06 0.61±0.05模型 7 1.34±0.10 1.85±0.03抗纤灵 8 0.52±0.02#△ 0.84±0.02#科素亚 5 0.80±0.03# 0.83±0.03#

3.4 各组大鼠肾组织肾损伤间质分数比较 见表3。纤灵组和科素亚组肾损伤间质分数较模型组均有下降（P＜0.05），其中抗纤灵组积分下降优于科素亚组，有统计学差异（P＜0.05）。

表3 各组大鼠肾组织肾损伤间质分数比较

3.5 各组大鼠肾脏病理形态学变化 模型组：肾小球局灶节段性硬化，部分肾小球新月体形成，硬化细胞数量明显增高，基底膜厚薄不均，结构不清。弥漫性肾小球系膜区增宽，毛细血管管腔狭窄，系膜基质轻中度增生；肾小管上皮细胞颗粒变性，细胞坏死脱落；肾小管扩张的管腔中可见管型；中重度纤维化并炎症细胞浸润于肾间质。

抗纤灵治疗组与科素亚组：肾小球局灶节段性硬化程度和硬化细胞数量较模型组明显减少。基底膜轻度增厚，小部分肾小球肿胀，小部分肾小球球性硬化，肾小球系膜区轻度增宽，系膜基质轻度增生，肾小管管腔扩张减轻，可见少量蛋白管型和细胞崩解碎片，局灶性免疫复合物沉积。肾小球新月体少量，肾间质有轻度纤维化，少量局灶性淋巴细胞浸润。抗纤灵组病理改善优于科素亚组。

图1 各组肾组织病理形态学比较（Masson染色）

4 讨论

国内外的文献研究表明，慢性肾脏病（Chronic kindey disease，CKD）的发病率已经超过10%[6-7]，各种CKD进展至终末期肾病（End stage renal disease，ESRD）的最后病理基础是肾脏硬化，即肾纤维化，造成肾小球单元功能毁损，形成临床上的尿毒症期。早期防止肾纤维化尤为关键。肾纤维化其共同病理改变就是肾小球硬化和肾间质纤维化（Renaliterstitialifbrosis，RIF），是导致肾功能丧失最主要的病理生理机制[8-9]。逆转或减缓肾间质纤维化的研究是当今肾脏病研究的热点之一，积极探索肾间质纤维化形成的机制，了解其发生发展机制，为诊断和治疗提供新的靶点和药物。

现代医学对肾脏病理变化的描述是肾间质纤维化，根据其慢性肾脏病中代谢功能紊乱、尿少、浮肿等临床表现可归属于祖国医学的“水肿”“癃闭”“关格”等范畴[10]。现代医学认为慢性肾病过程中普遍存在高凝状态，往往需抗凝治疗，正好归属中医“血瘀”范畴[11]。中医的瘀范围广泛，由于正气亏损，脾肾失调，湿、瘀、毒内蕴，气机不畅，往往需要疏血通络治疗，其对应病理表现为肾小球硬化球囊黏连，肾小球内微血栓，基底膜增厚，毛细血管腔塌陷或狭窄，血管襻挤压闭塞等改变，即肾纤维化表现。可见活血化瘀是治疗肾纤维化理论依据之一[12-13]。

由此可见临床抗肾纤维化治疗重要手段之一就是祛除肾脏的瘀血，因此在本研究中我们研究活血化瘀抗纤灵方的抗肾纤维化作用，并探讨其作用机制及靶点。该方由丹参、制大黄、黄芪、牛膝、桃仁、仙灵脾组成，该方以黄芪、仙灵脾为君药，黄芪性微温，功能补气升阳、利水消肿、固表生津；仙灵脾温肾壮阳，与黄芪二者相合，补气健脾、温阳补肾；方中三味臣药为丹参、桃仁、怀牛膝，丹参主要凉血活血，散结破瘀，“一味丹参，功同四物”，桃仁功能破血行瘀，善泄血分之壅滞，牛膝性善下行，有活血通经之能，又善补益肝肾，三药相济，共谋活血之理。制大黄更有活血祛瘀之功，扶正降浊，攻补兼施。

本文观察结果显示，抗纤灵方可明显降低阿霉素肾病大鼠 24 h尿蛋白量，降低尿素氮、肌酐水平，改善肾组织病理变化，降低肾小管硬化指数，表明该方具有保护肾功能，抗肾纤维化作用。

肾纤维化最重要的病理变化是由于成纤维细胞的异常增生，引起系膜细胞过度增生,以致细胞外基质（ECM） 的大量堆积[14-15]。体内有许多因子和酶参与调节细胞外基质合成与降解，使其保持动态平衡。TGF-β被认为是最重要促进细胞外基质合成增多的细胞因子之一[16-17]。其通过多方面促进肾小球细胞细胞外基质的合成积聚，主要是刺激细胞外基质受体合成，使细胞黏附于细胞外基质，同时TGF-β诱导多种细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF），CTGF又反馈作用于相关细胞，参与TGF-β促细胞外基质合成作用。CTGF是TGF-β的下游因子[18]，两者相互促进细胞外基质产生，抑制胞外基质蛋白降解，促进成纤维细胞和单核巨噬细胞的活动，及细胞外基质及细胞因子的表达分泌增加等多途径促进纤维化，抑制降解，因此CTGF在组织器官纤维化的发生、发展中起着重要作用[19-20]。本实验通过观察TGF-β、CTGF指标，探讨从影响细胞外基质合成降解来对肾纤维化的影响。本实验提示阿霉素肾病模型组TGF-β、CTGF表达增高明显，而在抗纤灵、科素亚治疗后，两者表达都明显降低，尤其抗纤灵组，TGF-β表达下降优于科素亚组，说明抗纤灵方对TGF-β调节有抑制作用，而使其下游因子CTGF表达受到抑制。通过肾损伤间质分数表达评价，抗纤灵组和科素亚组在病理学改变方面，2组均有改善肾纤维化表现，其中抗纤灵组改变优于科素亚组。

此外，科素亚作为血管紧张素受体拮抗剂，还有一定的肾脏保护作用，对肾间质纤维化也有一定的改善作用，为本实验证明。其对肾脏保护机制可能为激活或抑制一些细胞因子或信号转导途径。可拮抗血管紧张素II， 诱导足细胞表达血管内皮生长因子降低，提示ARB类药物可以通过下调足细胞的表达水平，而减少蛋白尿的发生，发挥保护肾脏作用[21]，其进一步机制有待研究来验证。

本实验证实抗纤灵方对阿霉素肾病大鼠模型的肾纤维化有一定改善作用，降低蛋白尿，改善肾功能具有一定的优势，尤其是改善肾脏病理方面更加明显，推测作用机制可能是通过抑制TGF-β水平，从而抑制CTGF水平，调节细胞外基质合成途径来实现的。