杞红液预防臭氧吸入联合冰水浴诱导大鼠血管纤维化的实验研究

张 睿，冯玄烨，王 湘，戴 宁，冯丽莉，赵 欣，蔡大勇，王玥琦*

（1.北京中医药大学中医学院，北京 100029；2.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193）

阳虚血瘀是衰老的重要因素[1]，在外界寒冷刺激下可加重血瘀程度，反复寒冷刺激可诱导血管产生血瘀的病理变化[2]。血瘀证如得不到恰当治疗，可加速衰老[3]。若单纯以活血化瘀药治疗此时的血瘀证，会损伤机体正气[4]。因老年人用药不宜过偏[5]，本实验用杞红液，由平性的枸杞子和微温的山楂组成，纠正衰老过程中外寒引起的血管损伤，通过研究血管内皮的损伤与修复，血液中髓过氧化物酶活力以及血管纤维沉积量和转化生长因子β1表达量，观察杞红液预防臭氧吸入联合冰水浴诱导大鼠血管纤维化的作用。

1 材料

健康雄性SD大鼠48只，体质量180～200 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2016-0002。MK3型酶标仪（赛默飞世尔（上海）仪器有限公司）；SleeMPS/P2型包埋机（德国SLEE公司）；RM2245型石蜡切片机（德国Leica）；全自动数字切片扫描系统KF-PRO-005型（宁波江丰生物信息技术有限公司）。枸杞子：北京同仁堂，批号20160722，山楂：北京同仁堂，批号20160712。杞红液：枸杞子与山楂质量比为2:1，由北京中医药大学关键技术中心提供。维生素E软胶囊，规格：100 mg/粒（批号160708），天津市中央药业有限公司。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS,批号20170310），髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO，批号20170315），以上试剂盒购于南京建成生物工程研究所。大鼠血管内皮素1ELISA试剂盒（endothelin-1，ET-1，批号QS-R20247），购于赛思博尔（北京）生物科技有限公司。转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）抗体，链霉亲和素-生物素复合物法免疫组化试剂盒（批号BA0290），购于武汉博士德生物工程有限公司。

2 方法

2.1 分组 适应性喂养3 d，大鼠随机分为对照组，模型组，阳性药组，杞红液低、中、高剂量组。对照组：连续28 d每日予以双蒸水（15 mL/kg）灌胃1次；模型组、阳性药组、杞红液低、中、高剂量组均于第1天开始，持续28 d隔日置于自制臭氧柜（1.2±0.2 L/m3）内染毒4 h[6-7]；第15天开始，每日置于0～4 ℃冰水中20 min，水深以没过大鼠身体1/2至2/3为宜，持续14 d[8]，同时模型组每日予以双蒸水（15 mL/kg）灌胃1次，阳性药组予以维生素E软胶囊（13.5 mg/kg）灌胃1次，杞红液低、中、高剂量组分别予杞红液（45、90、180 mg/kg）灌胃1次。第29天腹腔麻醉，腹主动脉取血，分离胸主动脉。2.2 指标检测

2.2.1 血清和指标 分离血清。严格按试剂盒说明书测定血清NOS、MPO水平。按ELISA试剂盒说明书测定血清ET-1含量。

2.2.2 组织病理学、纤维沉积形态观察 4%多聚甲醛固定血管，石蜡包埋，4 μm切片，Masson染色，中性树胶封片，扫描。KF-PRO-005型扫描系统40倍物镜下，随机获取每只大鼠5个视野显微照片，计算该照片下血管纤维面积比，以每只大鼠5个视野血管纤维面积比的平均数，作为该大鼠的统计数据。采用Image-Pro Plus显微分析系统，形态计量血管胶原纤维面积比。光镜下，Masson染色胶原纤维蓝染，胞浆红染。分析各组大鼠血管组织病理变化和血管纤维沉积面积比。

2.2.3 血管免疫组化TGF-β1表达量 另取蜡块，3 μm切片，3%过氧化氢避光孵育1 h，放于微波炉里进行枸橼酸缓冲液抗原修复，牛血清蛋白封闭后滴加一抗（兔多抗TGF-β1，1:200稀释）4 ℃孵育16 h，洗脱，滴加二抗（羊抗兔）37 ℃孵育30 min，二氨基联苯胺显色，苏木素核复染，中性树胶封片，扫描。光镜下，TGF-β1在细胞浆内显黄棕色，形态计量，对比分析各组大鼠血管TGF-β1的表达量。表达量＝平均光密度值×（积分光密度值÷平均光密度值×计量阳性细胞面积）3/2。

2.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件分析，各组数据以均数±标准差（）表示，各组数据均呈正态分布时，多组均数比较采用单因素方差分析（F检验），均数多重比较采用LSD检验（方差齐时）或Tamhane’s T2检验（方差不齐时）。

3 结果

3.1 对NOS、MPO活力、ET-1含量的影响 见表1。与对照组相比，模型组NOS活力下降，MPO活力上升，ET-1含量下降（P＜0.05）；与模型组相比，给药组NOS活力回升，MPO活力回降（P＜0.05）。杞红液中、高剂量可明显回升ET-1（P＜0.05）。

表1 NOS、MPO、ET-1（ ，n = 8）

表1 NOS、MPO、ET-1（ ，n = 8）

注：与对照组相比，# P＜0.05；与模型组相比，△P＜0.05

组 别 NOS/（U/mL） MPO/（U/L） ET-1/（pg/mL）对照组 20.49±2.34 28.27±5.35 203.08±27.38模型组 17.07±3.01# 48.43±12.17# 154.37±33.78#阳性药组 21.63±1.59△ 33.43±6.34△ 157.09±16.32#低剂量组 20.13±1.82△ 36.38±7.01#△ 179.61±22.82中剂量组 19.87±1.87△ 35.40±5.90△ 182.14±17.58△高剂量组 20.40±1.80△ 27.53±3.00△ 210.15±8.46△

3.2 对血管纤维沉积的影响 如图1、表2所示，胶原纤维主要分布在胸主动脉血管的中膜层和外膜层，与对照组相比，模型组和阳性药组纤维沉积较多（P＜0.05）；与模型组相比，杞红液低、中、高剂量组均可不同程度缓解纤维沉积（P＜0.05）。

图1 血管Masson染色（10×40）

3.3 对血管TGF-β1表达量的影响 如图2、表2所示，与对照组相比，模型组、阳性药组、杞红液低剂量组TGF-β1在血管的表达量增加；与模型组相比，杞红液低、中、高剂量均可不同程度回降TGF-β1在血管中的表达量。

图2 血管TFG-β1染色（10×40）

表2 纤维沉积表达量和TGF-β1在血管中的表达量（ ，n = 8）

表2 纤维沉积表达量和TGF-β1在血管中的表达量（ ，n = 8）

注：与对照组相比，# P＜0.05；与模型组相比，△P＜0.05

组 别 胶原纤维百分比% TGF-β1表达量%对照组 39.02±3.78 0.12±0.08模型组 57.90±8.38# 0.36±0.12#阳性药组 56.59±6.19# 0.34±0.18#低剂量组 47.33±3.91#△ 0.18±0.15△中剂量组 42.28±6.71△ 0.14±0.09△高剂量组 43.90±5.83△ 0.16±0.14△

4 讨论

衰老过程中人体的血管弹性减弱[9]，加上外界寒冷的刺激，血管的脆性增大，纤维化加重，易发生血管破裂从而引起血管疾病，本实验用大鼠模拟在臭氧致衰的状态下，经受外寒的刺激，研究杞红液对血管的保护作用。枸杞子性平味甘，滋补肝肾、益精明目[10]，具有降血脂、保肝、护肝等生物活性[11]，是治疗衰老最常用、最重要的中药[12]。山楂性温味酸，消食健胃，行气散瘀，化浊降脂，所含黄酮类化合物具有抗氧化作用[13]，实验研究证明，山楂可改善血液循环，具有活血化瘀作用[14]。

根据各项结果显示，经过臭氧染毒和冰水浴造模后，NOS活力下降，ET-1活力下降，MPO活力上升。NO是扩张血管能力最强的血管舒张因子[15]，在体内NO由NOS催化而成，NO和NOS的降低会促使白细胞黏附、提升低密度脂蛋白向血管壁渗透以及提升平滑肌细胞增殖，甚至促进血小板聚集，而易发生血管疾病[16]，由于NO半衰期极短，不易于直接检测，而研究NOS可以间接反应NO的程度。ET-1是收缩血管能力最强的血管收缩因子，通过激活钙通道以增加钙离子内流，促进血管平滑肌细胞收缩，检测干预前后NOS、ET-1的变化，可了解血管舒张功能[17]。大鼠血清中NOS降低, 可能是由于接触寒冷刺激, 产生的应激反应，而杞红液通过提升NOS活力，进而促进NO的合成，当血管受到寒冷刺激时，保护细胞不受侵害。MPO是NO的代谢酶，在病理状态下，过多生成的MPO直接与NO反应形成过NO2-，进而导致NO被消耗，MPO与动脉粥样硬化密切相关。TGF-β1是一种重要的调节细胞外基质积聚的细胞因子，是目前发现评价纤维化最强的因子，也是目前治疗器官纤维化的公认靶标子[18-19]，TGF-β1与狭窄血管数量呈负相关[20]，说明降低TGF-β1的含量有可能具有防止动脉硬化发生、发展的潜在功能。在Masson染色观察形态计量纤维沉积情况下，同时形态计量检测TGF-β1，可以直观反应纤维化程度，实验中杞红液低、中、高剂量都不同程度改善NOS、MPO活力，改善ET-1含量，可以缓解纤维的沉积，调节了血管的应激作用，降低了纤维化进程。