基于菌落形态、显微特征、DNA条形码三种策略鉴定僵蚕表面真菌＊

李红霞，徐 清，张 帆，罗雪梅，芦海生，刘春生，杨瑶珺

（1.北京中医药大学中药学院 北京 102488；2.中国中医科学院望京医院 北京 100102）

僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx moriLinnaeus 4-5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuilknt而致死的干燥体，具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结的功效[1]。现代研究表明僵蚕具有疗效高、活性强、临床应用广泛等特点，并且常年出口海外[2,3]。

近年来，中药的应用越来越广泛，中药质量问题受到人们的关注。有报道称中药饮片表面存在真菌污染的情况，这已经成为影响中药质量的主要因素之一。王文丽[4]对45份中药饮片进行检测，其中的43份有真菌检出，污染率达95%，曲霉属真菌和青霉属真菌为主要污染菌。秦筱茂[5]对9种常用中药的药用植物、个子货药材、饮片以及以其中7种药材为主要原料的中成药表面真菌污染情况进行检测，其中27份药用植物样品中分离出真菌354株，真菌污染率为96%，21份个子货和中药饮片中分离出7属54株真菌，真菌污染率为90%。李闽真等[6]对福建省中药材霉菌情况进行调查，12种中药材中检测到霉菌10属375540株，曲霉属和青霉属真菌为中药材的主要污染菌。目前关于中药表面真菌的研究主要集中在植物类中药，动物类中药表面真菌的研究较少，未查阅到关于僵蚕表面真菌的研究。

本研究对北京市零售药店收集的僵蚕饮片表面真菌进行鉴定。采用平板法培养僵蚕表面真菌，顶端纯化法对僵蚕表面真菌进行纯化，获得单一菌株。观察真菌菌落形态、显微结构特征，初步对真菌进行分类。提取真菌DNA，进行PCR扩增，测序结果输入NCBI数据库进行比对，进一步确定真菌的种类，综合三种方法共同鉴定僵蚕表面真菌。

1 材料

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

立式压力蒸汽灭菌器（LS-B95型 江阴滨江医疗设备厂）；OLYMPUS SXZ研究型体视显微镜（OLYMPUSBX51系统）；Gene Amp PCR System 9600 PCR扩增仪；Thermo Cell恒温金属浴（BIOER公司）；SIGMA3K-15低温高速离心机（德国SIGMA有限公司）；GRANT制冰机；QL-88B型旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器（THZ-C-1太仓市实验设备厂苏州培英实验设备有限公司）

1.1.2 试剂

氨苄青霉素储存液（100 mg·mL-1Coolaber公司）；甘油（Sigma-Aldrich公司）；乳酸酚棉蓝染色液（上海源叶生物科技有限公司）；真菌基因组DNA快速提取试剂盒（Biomiga公司）；2×Bench top taq master mix；引物（Sangon Biotech公司）；无菌双蒸水（上海源叶生物科技有限公司）

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Coolaber公司）

1.2 PCR引物

Primer 1：5-agaagtcgtaacaaggtttc-3，Primer 4：5-tcctccgcttattgatatgc-3

1.3 样品

2017年5 月从北京市8家零售药店收集僵蚕（蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx moriLinnaeus 4-5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuilknt而致死的干燥体）饮片。将收集的僵蚕饮片放入无菌自封袋内，密封，4℃保存备用（表1）。

2 方法

2.1 制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基

取43 g马铃薯葡萄糖琼脂培养基加水1000 mL，摇匀，121℃灭菌20 min。放凉至约50℃，加入氨苄青霉素储存液100 μL（100 mg·mL-1），制备培养基约50个，放于冰箱4℃备用。

2.2 培养僵蚕表面真菌

取僵蚕样品适量，采用震荡方式洗下僵蚕表面的真菌。将样品放置在摇床上，28℃、180 r·min-1震荡30 min，震荡结束后静置5 min。采用平板法对僵蚕表面真菌进行培养，取1 mL洗脱液接种于PDA培养基上，每个样品设置2个重复。接种后的平板在28℃下，避光培养5天。

2.3 菌丝顶端纯化法纯化僵蚕表面真菌

5天后，取出培养基，观察真菌的菌落形态，分别挑选形态不同的单一菌落，采用菌丝顶端纯化法，接种到新的PDA培养基中，每个培养基接种3个点，28℃下，避光培养5天。获得单一菌株，用于观察菌体在培养基中菌落形态与生长情况。

2.4 依据菌落形态与显微特征鉴定僵蚕表面真菌

取单一菌株，观察平板内菌落的形态、颜色、质地、直径等。用解剖针取一小块真菌，放于载玻片上，滴加乳酸酚棉蓝染色液染色30 s，制片。放置于光学显微镜下，观察真菌菌丝形态与颜色、孢子结构特征、足细胞等。结合真菌菌落形态与显微特征，依据《真菌鉴定手册》初步鉴定僵蚕表面真菌。

表1 中药饮片僵蚕样品信息表

2.5 依据DNA条形码鉴定僵蚕表面真菌

根据真菌基因组DNA快速提取试剂盒说明书提取DNA。提取得到的真菌DNA进行PCR扩增，反应体系为20 μL，体系包括：1 μL的DNA模板、1 μL的引物P 1、1 μL的引物P 4、10 μL的DNA聚合酶、加无菌水补充至20 μL。扩增步骤如下：94℃预变性90 s，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环反应30次，72℃5 min，4℃保持。PCR产物由上海生物工程股份有限公司测序，获得DNA序列结果，输入NCBI数据库进行比对，依据NCBI数据库比对结果进一步确定真菌种类。

3 结果

3.1 各批次僵蚕饮片表面所含真菌的数目及种类

分别对8个批次僵蚕饮片表面真菌进行培养。结果显示，从样品JC1中共分离得到5株真菌；样品JC2中共分离得到96株真菌；样品JC3中分离得到5株真菌；样品JC4中分离得到14株真菌；样品JC5中分离得到1株真菌；样品JC6中分离得到2株真菌；样品JC7中分离得到3株真菌；样品JC8分离得到101株真菌。从僵蚕饮片表面共分离得到227株真菌。

3.2 僵蚕表面真菌菌落形态与显微特征鉴定结果

图1 僵蚕饮片表面真菌形态与显微特征图

依据真菌菌落形态，采用顶端纯化法纯化真菌，获得单一菌株。根据真菌的菌落形态与显微特征，初步将227株真菌分为10种（图1）。结果显示，青霉属（Penicilliumsp.）真菌菌落圆形、边缘整齐，多为灰绿色。显微镜镜下可见菌丝、分生孢子梗具横隔，光滑或粗糙。顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，称为帚状体（Fig.9）。曲霉属（Aspergillussp.）真菌菌落圆形、边缘整齐，菌落边缘白色，中间产生孢子呈黑色。分生孢子梗由一根直立的菌丝形成，菌丝的末端形成球状膨胀（顶囊）（Fig.6）。黑曲霉（Aspergillus niger）菌落圆形，边缘白色，中间黑褐色。菌丝发达，多分枝，为多细胞真菌。分生孢子梗从特化的菌丝细胞（足细胞）上垂直生出，分生孢子头状如“菊花”（Fig.4）。依据菌落形态与显微特征初步鉴定僵蚕表面10种真菌中的曲霉属真菌、青霉属真菌、黑曲霉菌。

3.3 DNA条形码鉴定结果

僵蚕饮片表面共分离得到227株10种真菌，提取菌株DNA，采用分子鉴定方法共鉴定得到8种真菌，8种真菌分别为溜曲霉（Aspergillus tamariiFig.2）、黄曲霉（Aspergillus flavusFig.3）、黑曲霉（Aspergillus nigerFig.4）、聚多曲霉（Aspergillus sydowiiFig.5）、曲霉属真菌（Aspergillus sp.Fig.6）、Aspergillus jensenii（Fig.8）、青霉属真菌（Penicilliumsp.Fig.9）、焦曲霉（Aspergillus calidoustusFig.10），其中2株真菌无法进行鉴定（Fig.1、Fig.7）（表2）。Fig.3与Fig.6真菌的形态特征存在差异，显微结构相似，DNA条形码测序结果同为曲霉属真菌，Fig.3真菌可以鉴定到种，但Fig.6只能鉴定到属。基于真菌的菌落形态、显微结构特征、DNA条形码三种方法共同鉴定僵蚕表面真菌种类，初步了解北京市零售药店僵蚕表面存在真菌的状况，为研究僵蚕表面真菌提供参考依据。

3.4 小结

对僵蚕表面真菌进行培养，共得到227株10种真菌。结合3种鉴定真菌的方法，10种真菌中的8种可以鉴定，分别为溜曲霉（Aspergillus tamarii）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、曲霉属真菌（Aspergillus sp.）、Aspergillus jensenii、青霉属真菌（Penicillium sp.）、焦曲霉（Aspergillus calidoustus），其它2种为未知菌株。

4 讨论

4.1 僵蚕饮片表面真菌鉴定结果的准确性与差异性分析

本研究结果显示，JC2中分离得到96株真菌，JC8中分离得到101株真菌，其他6批中药表面真菌的数目较少，可见，JC2与JC8真菌数目的统计结果与其他6个批次真菌数目存在差异较大，可能与僵蚕的来源有关，本研究中使用的僵蚕饮片收集于北京市不同的零售药店，各药店的货源以及贮藏环境不同，并且，僵蚕是易霉变饮片，以上原因都可能导致僵蚕饮片表面真菌数目的不同。

本研究采用真菌菌落形态、真菌显微结构、DNA条形码三种方法共同鉴定僵蚕饮片表面真菌。三种鉴定方法各有优缺点，真菌菌落形态与显微结构只能初步将真菌分类，其鉴定结果需要采用分子鉴定进行进一步的确认。但是，DNA条形码检测结果存在一定偏差，如在PCR扩增和测序过程中可能引入潜在的偏差；同时，测序结果需要输入GenBank数据库进行比对，GenBank数据库主要充当归档文件，提交的许多序列存在标注不正确或定义不明确的物种名称。据估计超过10%的公开可用真菌ITS序列在物种水平上的注释不正确。此外，GenBank中的许多真菌ITS序列被注释为“未鉴定真菌”。因此就需要综合三种鉴定结果共同判断真菌的种类，本研究中的2株未知真菌由于未得到PCR产物，因此未得到鉴定结果，需要进行进一步的研究。

表2 僵蚕表面真菌DNA检测结果表

4.2 中药表面真菌污染现状及原因

中药多来自于野生或种植养殖的动植物，经历了生产、采收加工以及运输贮藏等多个环节，各个环节都有可能污染真菌。陈娟等[7]对7种根类药材中污染真菌进行分析。结果显示，从7份根类药材样品中分离到6属17种真菌，其中青霉属真菌为主要污染菌，共有9个种，镰刀菌属3个种，曲霉属2个种，其他属3个种。宋美芳等[8]对云南省主产的3种中药材上污染真菌进行了研究，并对不同贮藏时间中药材真菌菌株数量进行统计，说明随贮藏时间的延长，中药材表面真菌数量增加。在绞股蓝[9]、六神曲[10]、三七[11]和草果[11]上同样发现了真菌污染的情况。中药污染真菌的原因主要分为外因与内因，影响中药表面真菌污染的外因主要包括：温度、湿度、氧分压、pH等。除此之外，内部因素（营养物质）也是影响真菌生长的重要条件，如碳源、氮源、矿物盐等等。中药中含有大量的淀粉、糖、蛋白质、脂肪等物质，能够为真菌生长提供充足的营养物质。在适宜的温度、湿度、氧气等条件下，真菌可利用中药中的营养物质进行大量的繁殖[12]。僵蚕主要的活性成分为蛋白质，可以为真菌生长提供营养，因此僵蚕表面真菌的生长可能与其所含的化学成分有关。

4.3 研究中药表面真菌意义

本研究从僵蚕表面分离得到真菌227株，共计10种。通过观察真菌菌落形态、显微结构、DNA条形码共同鉴定得到8种真菌。张鑫等[13]从久贮陈皮中分离鉴定了25株真菌，分属于2属5种。该研究将黑曲霉返接种到无菌陈皮样品中，培养检测陈皮的化学成分，发现黑曲霉代谢转化与陈皮药效物质变化具有相关性，黑曲霉的代谢转化促进陈皮药材药效物质积累增加。从真菌黑曲霉与宿主陈皮药效物质基础变化的角度阐明“陈久者良”科学内涵[14]。可见中药表面真菌与中药药效存在一定的关系。但是，部分真菌产生的真菌毒素可能危害人体健康。有研究表明，真菌毒素与人体的某些慢性疾病、地方性疾病关系密切，部分真菌毒素甚至有致癌的可能[15]。真菌毒素由特定真菌产生，因此控制真菌生长，对切断真菌毒素的产生具有重要意义。可见，研究真菌对保证安全用药具有重要意义。