甘草止咳药效与其数字化颜色测量值的相关性分析＊

曹光昭，林相龙，俞越童，陈慧荣，闫永红，邹慧琴＊＊

（1.北京中医药大学中药学院 北京 100102；2.北京宝德润生医药科技发展有限公司 北京 100088）

自古以来甘草以外皮红棕色、断面黄白色者为佳，《本草经集注》称：“赤皮、断理，看之坚实者…最佳…”[1]，《新编中药志》载：“甘草以皮细紧、色红棕、断面黄白色、粉性足者为佳”[2]，由此可见，从颜色的角度来讲，表皮“赤皮”、“色红棕”，断面“黄白”为甘草质优的性状评价标准，感官颜色对甘草质量的鉴别至关重要。然而，描述颜色的语言存在一定的模糊性，例如：内蒙甘草，外皮红棕色、棕色或灰棕色；新疆甘草，外皮灰棕色或灰褐色；欧甘草，外皮灰棕色。三种甘草外皮都有灰棕色的描述，但是有品种、采集、加工、贮藏时间等条件的制约，这三种甘草的灰棕色怎样去比较？同一种甘草的棕色和红棕色；灰棕色和灰褐色又要怎样区分？无法准确的描述颜色真实情况，而且中药色泽传统的经验鉴别依赖于中药鉴定专家的感官评测，对鉴定者的要求较高，即使都是经验丰富的专家，在对中药材的主观感受上也不尽相同，主观性强，缺乏客观量化指标，造成了感官评价的不精确性[3,4]，这些问题仅靠老药工、专家等少数人的经验并不能完善的解决，而且这些制约了中药的颜色在质量评价中的作用。因此，很有必要结合对甘草颜色参数的测定，并对其进行量化处理，将传统经验鉴别转化为可客观、量化的智能化识别模式[5]，实现中药辨色论质简单、快速、实用[4]。

为此本研究引入广泛应用于许多行业的颜色测量仪器来对甘草进行颜色测定，得出定量描述的数值，为用数字化的颜色与质量的相关性分析以及用定量的颜色数据来为甘草颜色定标准，从而快速的评价甘草的质量打下基础，为甘草颜色的数字化提供了保证。色度学是一门研究颜色计量的科学，其任务在于研究人眼颜色视觉的定性和定量规律及应用。每个人的视觉并不完全一样的。在正常视觉的群体中间，也有一定的差别。目前在色度学上为国际所引用的数据，是由在许多正常视觉人群中观测得来的数据而得出的平均结果。本研究是采用分光测色计对样品进行测定，色度仪利用的是CIEL*a*b*色空间系统，该系统常用于计算物体表面色的色差[6]，它是利用L*，a*，b*三个不同的坐标轴，指示颜色在几何坐标图中的位置及代号，对测试样品的颜色进行客观表征[5]，在这个色空间中明度L*，色度a*和b*3个坐标轴互相垂直。a*和b*表示不同的色调方向，a*表示红色，-a*表示绿色，+b*表示黄色，-b*表示蓝色，颜色的明度由L*的百分数来表示[7,8]，明度越大，越偏白；明度越小，越偏黑[9]。

L*：值越大明度越大，感觉越白；值越小明度越小，感觉越暗。

a*：表示红绿方向，+a*表示红方向，-a*表示蓝方向。

b*：表示黄蓝方向，+b*表示黄方向，-b*表示蓝方向。

ΔE*ab={(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2}1/2:ΔE*ab为色差，通常认为其小于或等于1时，人眼将无法分辨两种颜色的差异。

甘草性味甘平，归心肺脾胃经，有补气健脾、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和诸药之功效。甘草颜色往往与药效有着密切的联系，现代药理学认为甘草具有止咳[10-12]、抗溃疡[13]、抗炎、解毒[14]、抗病毒解痉止痛、调节免疫功能，对糖尿病的并发症有预防作用[15]。目前国内对于止咳药效报道相对较多，认为甘草口服后能覆盖在发炎的咽部粘膜上，缓和炎性刺激而镇咳，并且能促进咽部和支气管粘膜分泌，使痰易于咳出，呈现祛痰镇咳作用，而且该药效较易量化。因此，本文选择了甘草止咳这个的药效指标来进行研究。中药质量评价方法由传统经验鉴别到应用现代理化分析技术鉴别，不断的在更新、发展。目前的甘草质量评价方法有产地评价、基源评价、性状评价、形态组织学方法、化学成分含量测定方法、指纹图谱等方法，但性状评价从古到今被广泛采用，至今依然是甘草药材质量评价重要的方法，尤其在甘草的性状评价中，颜色的鉴别与质量的好坏密切相关[16]。已经有相关研究表明甘草颜色与内在物质基础存在相关性[17]，故通过氨水引咳法对小鼠进行干预，研究甘草断面颜色与有效成分之间的关系，以探讨颜色数字化值与中药质量评价的相关性，揭示传统中药材性状鉴别的科学性。

1 实验材料

1.1 样品和材料

甘草，2010年10月收集于内蒙古杭锦旗、甘肃玉门野生及三年生栽培甘草，根据前期实验结果，本试验选取的四种甘草样品依据传统颜色性状分类杭锦旗野生甘草被分在第一类，玉门野生甘草在第二类，杭锦旗三年生栽培甘草在第三类，而玉门三年栽培甘草在第四类，以人眼观察，这四份样品间颜色性状差异明显，通过样品断面颜色色差结果及样品表皮颜色色差结果发现这四份样品间断面和表皮颜色间色差值均大于1，四份样品能较为全面的代表不同类别的甘草品种，因此选取这四份样品进行甘草止咳药效与其数字化颜色测量值的相关性分析（表1）。所有样品均经北京中医药大学中药资源与鉴定系闫永红教授鉴定，确定为甘草G.uralensisFisch（表1）。

1.2 仪器

ZN-02小型粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）；U-3010紫外可见分光光度计（日本日立公司）；402AI超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备有限公司生产。

1.3 试剂与药品

氨水（分析纯），汕头市西陇化工股份有限公司生产。磷酸苯丙哌林片（一力咳），上海全宇生物科技遂平制药有限公司。

1.4 实验动物

ICR小鼠，雌雄各半，体重18-20 g（北京维通利华实验动物技术有限公司）。

2 方法

2.1 甘草断面颜色测量方法[9]

2.1.1 样品制备

将甘草切成长约2 cm的小段，对甘草段施以压力，令表皮脱落，将去皮的甘草段打粉，过3号筛，粉末置于自制玻璃测色皿中，盖上石英镜片，以测色皿中粉末不随意晃动为准。

2.1.2 颜色测定条件

采用日立3010紫外可见分光光度计进行测量，测量起止波长：380-780 nm；狭缝宽度：1 nm；照明光源：D65；视场选择：10度视角；扫描速度：600 nm·min-1。

就这样，尹爱群在两个家之间周旋，格外谨慎了。晚上从不在外过夜，周末仍像以前那样，陪妻子逛街看电影，晚上散步，拉着妻子的手，恩恩爱爱。他去扬扬那里的时间，改为上班时间了，他是一把手，谁约束他呢！反正扬扬不上班，二人大白天大部分时间就是赖在床上，尽情地做爱，之后裸着身体，猫着腰去厕所，之后看电视，再后就是品尝扬扬的烹饪手艺。扬扬擅长厨艺，她读的是职业学校烹饪专业。厨房里工具齐全，光刀具就十多把。其中一把又长又锋利的尖刀，扬扬一直不知道什么用途。

2.1.3 精密度考察

杭锦旗野生样品，按上述供试品制备方法制备供试品，连续测量5次。测量结果RSD均小于3%，结果间ΔE*ab均小于1，ΔE*ab平均值=0.09，色差低于人眼可变范围（表2、表3）。表明结果稳定。

2.1.4 稳定性考察

随机取杭锦旗野生样品5份，按上述供试品制备方法制备供试品，分别进行测量。测量结果显示RSD均小于3%，结果间ΔE*ab均小于1，ΔE*ab平均值=0.52，色差低于人眼可变辨范围（表4、表5）。表明结果稳定。

2.2 提取液的制备

取甘草样品50 g，称定，加水浸泡1 h，文火煎煮提取两次，每次加水250 mL。提取40 min。过滤，水浴浓缩至0.32 g·kg-1。放置冰箱中备用。

2.3 小鼠氨水引咳法

小鼠140只，雌雄各半，按性别体重分为14组，即空白组，阳性对照组（一力咳38 mg·kg-1）和四组甘草样品各自大、中、小剂量组。每组10只（雌雄各半），每天给药一次，连续给药7天，实验前动物禁食不禁水16 h，末次给药后30 min即开始测量，将小鼠放入带自制盖子的大烧杯中用超声雾化器以恒定压力匀速将25%氨水喷入烧杯中，雾化5 s，观察记录小鼠的咳嗽潜伏期（从喷入氨水到小鼠第一次咳嗽的时间）和2 min内咳嗽次数（以小鼠腹肌收缩张大口为准，有无咳嗽声音均可）。

《中国药典》中甘草人体推荐剂量上限为9 g，人体重按照70 kg计，则人体推荐剂量为0.128 g·kg-1。实验中设计小鼠中剂量为人体等效剂量，根据FDA小鼠人体剂量换算中提供的折算系数12.3折算，小鼠中剂量约为1.6 g。另以中剂量的2倍，1/2倍设计高，低剂量组。本实验中大剂量为3.2 g·kg-1，中剂量为1.6 g·kg-1，小剂量为0.8 g·kg-1。

2.4 数据的统计方法

表2 精密度考察指标值

表3 精密度考察色差结果

表4 稳定性考察指标值

表5 稳定性考察色差结果

表6 断面颜色测量指标值

表7 甘草止咳作用结果

表8 止咳药效与L*、a*、b*相关系数

3 结果

3.1 按照2.1方法，对4批甘草样品分别进行颜色值的测量，分别测量L*、a*、b*的值，L*代表明度、a*为绿红，b*为黄蓝，每个样品重复测定三遍，记录颜色指标的平均值（表6）。

表6结果表明，从断面颜色看，眼观为黄色的样品相应的明度值L*值偏小，颜色偏暗；+b*值偏大，颜色偏黄。因此断面颜色测量值同断面传统性状分类进行分析比较，发现断面颜色测量结果同人眼观察断面颜色存在一致性。结果表明甘草断面可以量化，并且量化结果能够反映颜色的真实情况。

3.2 计算止咳率，止咳率（%）=实验组咳嗽潜伏期/空白组咳嗽潜伏期×100%（表7）。

表3结果表明，阳性对照组小鼠咳嗽潜伏期时间延长，2分钟内咳嗽次数降低。与空白对照组比较差异有显著性意义（P＜0.01）。杭锦旗野生甘草，玉门野生甘草大剂量组小鼠咳嗽潜伏期时间均有延长，2分钟内咳嗽次数均有不同程度降低。与空白对照组比较有显著差异（P＜0.01）。其余各组样品咳嗽潜伏期同空白组比较没有显著性意义，但是2分钟内咳嗽次数均有不同程度降低，与空白对照组比较存在显著差异。只有玉门小剂量组2分钟内咳嗽次数同空白组比较不存在显著性意义。从2分钟内咳嗽次数降低程度来看，各组甘草样品大剂量组＞中剂量组＞小剂量组。大剂量组间比较，野生甘草明显优于人工栽培甘草。中剂量组和小剂量组中，野生甘草和栽培甘草差别不明显。

3.3 将甘草止咳药效分别与颜色指标值L*、a*、b*相关联，使用SAS软件做相关分析，结果见表8。

表4结果表明，发现指标值L*、a*和甘草止咳作用之间不存在显著相关，说明指标值L*、a*和止咳作用之间没有统计学意义，表现不出量效关系。指标值b*和止咳作用之间存在显著相关，说明b*和止咳作用之间有统计学意义，即在一定程度上，b*值增大，止咳作用效果增加。

4 讨论

本实验对4份样品的断面颜色进行了测量，并对4份样品进行了药效学实验，结果表明传统性状颜色分类结果中质量较优的样品止咳作用＞质量一般＞质量较差。将止咳作用结果同颜色测量结果结合分析，发现四种样品断面颜色L*值和a*值存在差异，两份野生甘草样品的b*值大于栽培甘草样品，在大剂量组间，野生甘草药效优于栽培甘草，而且b*值较大的杭锦旗野生甘草药效优于玉门野生甘草，推测甘草断面颜色b*值增大，止咳作用效果增加。相同产地的样品，有L*值降低，a*值上升，止咳作用越好的趋势，且颜色性状鉴别认为质量较优的样品止咳作用也较好。甘草样品存在断面颜色越黄，止咳作用越好的趋势。

上述实验结果也表明，野生甘草效果优于人工栽培甘草，但具体的止咳机理尚不明确。野生甘草同人工栽培甘草在有效组分含量及组分比例方面均存在较大差异，但是止咳机理有待于进一步深入研究。上述结论也表明了将人工栽培甘草完全取代野生甘草还存在一些问题亟待解决。同种甘草剂量不同，实验结果有显著差异，说明存在一定的量效关系，有待于进一步深入研究。

本文结合颜色测量结果初步尝试分析了甘草断面颜色同止咳作用的相关性。结果表明，甘草断面颜色同止咳作用存在一定相关性，甘草颜色断面与颜色指标值b*联系密切，色度计的应用说明可以使甘草颜色数字化，并通过颜色数字化信息推断甘草颜色越黄，止咳作用越好的趋势，为甘草颜色的测量提供了支持，为将色度测定方法推广应用于其他药材的颜色测量提供理论依据。为完善中药性状鉴别提供了参考，推动了传统学科的发展创新。