美洲大蠊提取液对慢性难愈合创面细胞凋亡、蛋白聚糖及透明质酸表达的调控机制研究＊

曾娟妮，李文华，刘 筱，杨 敏，周雯婷，刘越飞，沈咏梅，何永恒＊＊

（1.湖南中医药大学第二附属医院肛肠科 长沙 410005；2.湖南中医药大学 长沙 410208；3.成都高新好医生第一医院 成都 610202）

慢性难愈合创面是指因多种外界或内在因素引起经治疗1个月以上愈合进展缓慢或仍未愈合的创面[1]。临床中难愈合创面主要有糖尿病足溃疡、肛瘘术后创面、压疮等。细胞凋亡是一种主动的、程序性的由基因控制的细胞自主性死亡方式，可清除机体衰老、畸变或恶化细胞，是多细胞生物维系其结构稳定和内环境功能平衡及生长发育必须的最基本的生物学过程[2]。肉芽组织的形成与收缩是创伤恢复过程的重要内容，在创面愈合中通过凋亡的方式使肉芽组织中的炎性细胞、成纤维细胞等各类细胞数量减少，从而促进伤口愈合。现代研究发现，细胞凋亡在慢性创面愈合过程中起着关键作用，美洲大蠊提取物可以诱导肿瘤细胞凋亡（Death Effector Domain，DED），那美洲大蠊是如何作用于DED的呢？透明质酸与蛋白聚糖是增殖细胞核迁移细胞胞外基质的主要成分，两者如何影响创面的修复？该实验应用Real Time-PCR观察凋亡基因的表达、运用Western blot检测细胞外基质的重要组成部分透明质酸与蛋白聚糖的光密度，从而进一步探究美洲大蠊提取液对慢性难愈合创面的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年SPF级Wistar雄性大鼠60只（购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，来源证号：43004700026384），12周龄，体质量220 g-250 g，适应性喂养1周。

1.2 主要仪器设备及试剂

紫外/可见光分光光度计（Lambda35，美国Perkin Elmar公司），核酸蛋白分析仪（Bio-Photometer D30，德国eppendorf公司），实时定量PCR仪（CFX Connect，美国Bio-Rad公司），Trizol（批号15596-026，美国GIBCO公司），DNA Marker（批号SM0672，Fermentas公司），逆转录试剂盒（A3500，promega公司）、Real-time PCR mix（批号4367659，thermo fisher公司），引物购自上海生工公司。贝复济15 mL/瓶（批号S10980075，珠海亿胜生物有限公司）；美洲大蠊提取液100 mL/瓶（商品名：康复新【含有尿嘧啶、丙三醇等成分，不含透明质酸及蛋白聚糖】[3]，批号Z51021834，四川好医生攀西药业有限公司）。

1.3 分组及模型制备

将SPF级Wistar雄性大鼠随机分为：急性全层皮肤缺损对照组（简称对照组），慢性创面组分为模型组、美洲大蠊提取液实验组（简称实验组）、贝复济阳性组（简称阳性组）（n=15）。全层皮肤缺损+激素法制成大鼠慢性难愈合创面模型[4]。20%乌拉坦（5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠后，在其背中部脊柱两侧旁开1 cm，距肩胛骨以下2 cm用外科方法作两条深达筋膜、直径为18 mm的全层皮肤缺损开放性创面；造模后即刻皮下注射醋酸氢化可的松（6 mg·100 g），模型组、实验组、阳性组大鼠按上述方法制备慢性难愈合创面模型。对照组按前述全层皮肤缺损法制成大鼠模型，但不注射氢化可的松；

1.4 换药及取材

各组创面制备后每日用相应药物治疗，实验组所敷纱条用康复新液（0.2 mL/cm2），阳性组所敷纱条用贝复济（60 u/cm2），对照组与模型组创面所敷纱条用生理盐水（0.2 mL/cm2）。各组于第3天、第8天、第15天、第20天随机取3只大鼠取造模区深达真皮全层的创面组织被试管固定液中待用，所有大鼠在第20天取材后统一处死。

1.5 荧光实时定量PCR检测

所取组织样品投入RNAstore样本-80℃保存液中冻存，进行Real-Time PCR检测。以β-action为内参基因，模型组第3天的△CT为参照，比较各组2-△△CT差异。

1.6 Western blot检测

图1 bax mRNA的扩增曲线

图2 bcl-2 mRNA的扩增曲线

图3 caspase3 mRNA的扩增曲线

第3天、第8天、第15天、第20天，每组随机取3个样本组织进行Western blot检测，用图像分析软件IPP6.0对图像进行灰度分析。

1.7 统计学分析

使用SPSS23.0统计软件，数据以x±s表示，满足方差齐性检验，采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法，若方差不齐，采用秩和检验。

2 结果与分析：

2.1 PCR对bcl2、bax、caspase3的检测

2.1.1 bax、bcl-2、caspase3、β-actin的扩增曲线分析

bax、bcl-2、caspase3扩增曲线图中，CT值在20-35之间，平台期较稳定，拐点清晰，线性关系良好，B图中bcl-2的Ct值最小最集中，纯度最佳，对PCR反应的影响最小（图1-3）。

2.1.2 以模型组第3天2-△△CT为参照，各组的基因表达倍数差异（表1-3）。

表1中，在第3天、第8天、第15天、第20天，模型组与对照组比较有明显统计学意义，模型组表达最高，对照组最低（P＜0.01）。模型组与阳性组比较有显著统计学差异，模型组高于阳性组（P＜0.01）。模型组与实验组比较有显著统计学差异，模型组高于实验组（P＜0.01）。在第3-20天，对照组与模型组组内的表达有显著统计学差异（P＜0.01），实验组与阳性组的愈合周期变化无统计学差异（P＞0.05）。

表1 各组bax的2-△△CT比较（x±s）

表2 各组bcl-2的2-△△CT比较（x±s）

表3 各组caspase3的2-△△CT比较（x±s）

表2中，在第3天、第8天、第15天、第20天，对照组与模型组比较有显著统计学差异，对照组表达明显高于模型组（P＜0.01）；阳性组与模型组比较无统计学差异（P＞0.05）。在第3天，实验组与模型组比较无统计学差异（P＞0.05），第8-20天，实验组与模型组比较有显著统计学差异，实验组表达均高于阳性组（P＞0.05）。第3-20天内，对照组的愈合周期表达无统计学差异（P＞0.05），而模型组、阳性组、实验组的愈合周期有明显统计学差异（P＜0.01）。模型组与阳性组在第3-15天缓慢下降，至20天上升；实验组在第3-15天逐渐上升，至20天下降。

表3中，在第3天、第8天、第15天、第20天，模型组与对照组比较有明显统计学意义，模型组表达最高，对照组最低（P＜0.01）。模型组与阳性组比较有统计学差异，模型组高于阳性组（P＜0.05）。模型组与实验组比较有统计学差异，模型组高于实验组（P＜0.05）。在第3-20天，对照组与模型组的周期表达变化均无统计学差异（P＞0.05），阳性组与实验组的愈合周期变化有明显统计学差异，两者第3天表达均最高，后逐渐缓慢下降（P＜0.01）。

2.3 Western blot对透明质酸与蛋白聚糖的检测如下图4-6

条带干净清晰，无拖尾、变形、跑带等现象，符合实验要求（图4）。

图5，6中，对照组与模型组的透明质酸及蛋白聚糖比较均有显著统计学差异，对照组的两者表达均高于模型组（P＜0.01）。阳性组与模型组的透明质酸及蛋白聚糖比较均有显著统计学差异，阳性组的两者表达均高于模型组（P＜0.01）。实验组与模型组的透明质酸及蛋白聚糖比较均有显著统计学差异，实验组的两者表达均高于模型组（P＜0.01）。慢性创面3组透明质酸及蛋白聚糖表达在第3天最高；模型组呈逐渐下降趋势，阳性组第8天最低，第15天逐渐升高，第20天稍下降；实验组第8天最低，第15天、20天逐渐升高（P＜ 0.01）。

3 讨论

慢性难愈合创面是外科临床的疑难病症，具有病因复杂、病程长、反复发作以及可能癌病等特点[5]。现代研究指出凋亡是创面整个愈合过程中细胞数量减少的最基本、最重要的方式，也是创面愈合过程中非常重要的组成部分[6,7]。这些过程主要由抑制凋亡蛋白（Bcl-2）家族蛋白、半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族蛋白调控凋亡信号的传导，彼此相互制约组成一个完整、高效的凋亡机制网络系统[8，9]。Bcl-2家族蛋白根据成员结构和功能的不同可以分为抗凋亡成员（BCL-2、BCL-xL）和促进凋亡成员（Bax、Bak、Bid、Bim 等)［10］。而bax与bcl-2分别是促进凋亡和抑制凋亡最典型的代表基因。caspase家族蛋白酶可直接导致细胞凋亡解体，其成员中caspase3是细胞凋亡的关键蛋白酶，若被激活，将导致下游的级联反应。因此，研究bcl-2/bax与caspase3在创面修复过程中的表达及调控，对探索细胞凋亡与机体组织损伤的修复及再生具有十分重要的意义。透明质酸是一种酸性粘多糖，能调节蛋白质、水电解质扩散及运转，蛋白聚糖可与细胞外基质中的胶原、纤粘连蛋白、层黏连蛋白及弹性蛋白结合，构成组织特性的细胞外基质，共同促进创伤愈合。

图4 蛋白聚糖与透明质酸的条带图

图5 各组创面中蛋白聚糖表达情况

图6 各组创面中透明质酸表达情况

本实验中实验组与未用药物干预的模型组比较，bax、bcl-2、caspase3表达有明显的差异。Bax与bcl-2的比值关系决定创面的修复质量，bax占优势细胞凋亡，bcl-2占主导时细胞存活[11]。模型组的bax在愈合周期内表达均最高，第3天、第8天、第15天的表达逐渐上升，第20天较前下降，表明前中期创面大量细胞凋亡，损伤严重，后期凋亡速度减慢；对照组与模型组相比，表达较低，愈合周期内bax的变化缓慢；阳性组与实验组表达低于模型组，周期表达变化差异不明显，处于稳定适中水平。Bcl-2中，模型组的Bcl-2的表达较其他三组低，前中期逐渐升高，后期降低；阳性组的表达明显高于模型组，前期表达最高，中后期下降；实验组前中期表达逐渐升高，中期达到顶峰，后期下降。Caspase3中，模型组的表达均高于其他三组，愈合周期内表达变化差异不明显，阳性组与实验组前期表达较高，而后处于持续下降的水平。结合三者基因的表达情况，对照组bax、caspase3的低表达，bcl-2高表达，表明创面修复进程中细胞凋亡较少，组织轻度损伤。模型组bax与caspase3高表达，bcl2低表达，组织细胞过度凋亡，可导致使创面延迟愈合[12]。而阳性组与实验组基因表达情况，优于模型组。阳性组bax前中期上升，后期略下降，caspase3前期表达较高，而后缓慢下降，bcl-2前中期下降，后期略上升，前中期细胞凋亡祛除坏死组织与后期抗凋亡利于组织再生使创面修复。实验组表明美洲大蠊提取液在创面愈合前期使bax、caspase3 RNA表达维持较高水平，加快创面腐肉组织脱落，中期bax、caspase3表达均缓慢下降，bcl-2上升，有利于组织的生长；bax在后期表达略升高，bcl-2、caspase3下降可减少组织的过度增生避免形成瘢痕疙瘩[13]，从而促进慢性创面的愈合。

实验组的蛋白聚糖与透明质酸的表达明显高于模型组。透明质酸与蛋白聚糖在第3天左右达到旺盛，可促进细胞迁移及增殖，使伤口炎症反应减轻；第8天稍降低，而后继续上升，促进组织的成熟和老化。表明实验组两者的表达情况明显优于模型组。

综上所述，美洲大蠊提取液能高效调控凋亡基因的趋势化、提高透明质酸、蛋白聚糖的表达，加速难愈合创面的修复进程，为美洲大蠊提取液在临床慢性创面的应用提供了进一步的科学依据。