硅对盐胁迫下甘草非药用部位总黄酮、总皂苷积累动态的影响＊

王建寰，张文晋，郎多勇，解植彩，张新慧,2＊＊

（1.宁夏医科大学药学院 银川 750004；2.宁夏回药现代化工程技术研究中心/宁夏回医药协同创新中心/回医药现代化教育部重点实验室 银川 750004；3.宁夏医科大学实验动物中心 银川 750004）

甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）为豆科甘草属多年生草本植物，是世界自然基金会全球14个重点保护物种之一，也是我国2000多种中药中用量最大的一味药材[1]。甘草以干燥的根和根茎入药，具有清热解毒、润肺止咳、调和诸药等功效，素有“众药之王”、“十方九草”等美誉[2]。甘草中的有效成分主要为黄酮类、皂苷类、多糖类物质[3]。甘草的供应长期以野生资源为主，过度采挖使得其野生资源严重匮乏，1984年国务院颁布了禁挖甘草的禁令，甘草成为了国家重点专控药材。随着甘草野生资源日益枯竭及现代社会环境保护意识的加强，栽培甘草越来越成为甘草原料的重要来源。一般而言，栽培甘草生长周期为3-4年，每年可产大量甘草茎、叶资源[4]。但是，栽培甘草茎、叶多在秋季采割作牧草储备，且对甘草药理作用的研究主要集中在地下部位[4]。因此，合理开发利用甘草地上非药用部位资源，契合当下生态文明建设要求及循环经济发展需求，必将成为甘草研究的热点之一。

同一药用植物的不同部位，由于不同的性状特点及主要成分积累分布质与量的差异，导致不同药用部位药理作用有一定差异，从而产生了中药使用中普遍存在的“一体多用性”现象，这也是扩大药用部位、发现新药源、综合利用药物资源的重要途径。研究表明甘草叶中总黄酮能诱导腹腔和骨髓巨噬细胞产生具有杀伤作用的细胞毒因子[5]，并且能够抑制胃酸分泌过多[6]和胶原蛋白诱导及二磷酸腺苷诱导的血小板聚集，具有较大的开发潜力[5]。

此外，栽培甘草主要分布在我国西北的盐渍化地区[7]。研究表明盐胁迫对甘草生长有一定的抑制作用。当NaCl浓度达到50 mmol/L或0.3%时就会显著抑制甘草幼苗或二年生移栽苗的生长，且这种抑制作用具有浓度效应[8,9]。目前土壤盐渍化已成为困扰甘草栽培的重大问题之一，因此，合理开发利用盐渍化地区的栽培甘草也成为目前研究的热点。

硅是植物生长发育的有益元素，也是一种环境友好型元素[10]，尽管它能否被认定为植物生长发育的必需元素仍然存在较大争议，但是近年来大量研究表明，外源硅既能促进植物生长发育，也可以降低盐胁迫对植物的伤害，提高植物对盐胁迫的抗性[11]。但鲜有外源硅对盐胁迫下药用植物非药用部位活性成分的相关研究。

因此，本文研究了硅对盐胁迫下甘草非药用部位主要有效成分（总黄酮、总皂苷）积累动态的影响效应，探讨盐胁迫下不同浓度外源硅对甘草茎、叶中总黄酮、总皂苷的年积累动态规律，为更好地开发利用甘草地上部位资源，提高甘草非药用部位有效成分、选择适宜的甘草茎叶采收期，合理进行甘草地上部茎、叶资源的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验用甘草材料为一年生甘草幼苗，采自宁夏盐池县甘草种植基地，经宁夏医科大学药学院张新慧教授鉴定为甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）。芦丁（批号120927，上海融禾医药科技有限公司）；甘草苷（批号13020901，成都曼思特生物科技有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 实验材料的培养

在通风、光照良好的室外开展盆栽试验。试验设置1个盐胁迫水平，盐基采用NaCl，浓度为6 g·kg-1风干土，硅源采用K2SiO3，浓度分别为风干土重的0、0.2、0.4、0.6 g SiO2/kg，共计4个处理组合。每盆装风干土20 kg，风干土有机质含量为0.6217%，全氮0.0226%，速效磷10.5159 mg·kg-1，有效钾107.5697 mg/kg。装土时将NaCl和K2SiO3与土壤充分混合，试验中因加入K2SiO3引入的K+，用KCl来维持K+浓度的一致。将同时育苗、管理一致、长势一致的甘草苗根长修剪为20 cm，移栽于试验盆中，每盆10株。盆栽试验的管理措施与当地大田管理一致。

1.2.2 实验材料的收集

7月至9月中旬，每隔30 d采集整株甘草，并分为主根、茎、叶部位，分别经烘干、粉碎、过筛后备用。对不同采样期的甘草茎、叶分别测定其总黄酮、总皂苷含量，进行动态积累考察。

1.3 总黄酮含量的测定

1.3.1 总黄酮的提取

精密称取甘草干燥茎、叶粉末约0.5000 g，置于25 mL容量瓶中，加入80%乙醇（含0.3%的氨水）定容，40℃超声提取90 min，其上清液即为总黄酮提取液。

1.3.2 标准曲线的绘制

精密称定芦丁纯品0.0100 g，用50%的乙醇超声30 min溶解，摇匀，冷却，定容至50 mL，得0.2 mg·mL-1的芦丁对照品溶液，冰箱中保存，备用。精密吸取上述芦丁对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别加入5%（g·L-1）NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，静置5 min后加入0.3 mL的10%的硝酸铝溶液，放置5 min，再加l mol·L-1NaOH 2 mL，用50%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置6 min。在353 nm测定其吸光度，以芦丁含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制回归曲线（图1），求得回归方程为：Y=5.0586X+0.0088（R2=0.9995），表示芦丁在0.04-0.24 mg范围内线性关系良好。

1.3.3 样品含量测定

吸取总黄酮提取液15 mL，分别加入5%（g·L-1）NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，静置5 min后加入0.3 mL的10%的硝酸铝溶液，放置5 min，再加l mol·L-1NaOH 2 mL，用50%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置6 min。在353 nm测定其吸光度，并计算相对样品的含量（mg·kg-1）

1.3.4 方法学考察

取甘草叶粉末进行方法学考察，精密度RSD值为1.23%；重复性RSD值为0.93%；加样回收率96.23%，RSD值为1.87%；样品在8 h内稳定。

1.4 总皂苷含量的测定

1.4.1 总皂苷的提取

精密称取甘草干燥茎、叶粉末约0.1000 g放置于10 mL带刻度试管中，加10 mL甲醇，超声40 min，离心3 min（3500 r·min-1），取其上清液，并用甲醇定容至10 mL，作为总皂苷提取液。

1.4.2 标准曲线的绘制

准确称取人参皂苷Re对照品0.0026 g，用甲醇溶解并定容至10 mL，配置成浓度为0.26 mg·mL-1的人参皂苷Re标准溶液，作为对照品贮备液，冰箱中保存，备用。精密吸取人参皂苷Re对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL的具塞试管中，水浴蒸干溶剂，再依次加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL摇匀后，加入60%H2SO4溶液5 mL，混匀，在60℃水浴加热20 min，立即以冰水冷却，选用甲醇为空白对照，在523 nm测甘草样品的总皂苷含量。以人参皂苷Re含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制回归曲线（图2），求得回归方程为：Y=3.1407X+0.0047（R2=0.9942），表示人参皂苷Re在0-0.260 mg范围内线性关系良好。

1.4.3 样品含量测定

分别吸取制备好的根、茎、叶样品溶液1ml，加入0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液，摇匀后加入60%H2SO4溶液5 mL，混匀，在60℃水浴加热20 min，立即以冰水冷却，冷却到室温后，加入2 mL冰乙酸，523 nm处测定吸光度值，并计算相对样品的含量（mg·kg-1）。

1.4.4 方法学考察

精密度RSD值为1.45%；重复性RSD值为1.78%；加样回收率为98.45%，RSD值为2.33%；样品在8h内稳定。

1.5 数据分析

试验数据采用SPSS 17.0软件进行方差分析和显著性检验，方差分析多重比较用Duncan法（P＜0.05）；采用Excel 2003作图。各图中的数据均为6次重复的平均值±标准误。

2 结果

2.1 硅对盐胁迫下甘草茎、叶中总黄酮积累动态的影响

图1 芦丁标准曲线

图2 人参皂苷Re标准曲线

甘草茎中总黄酮含量在采样期内呈“V”字型变化，先逐渐降低，在8月达到最小值，而后略有增加；叶中总黄酮含量在采样期内呈倒“V”字型变化，在8月底达到最大值（图3）。从整个采样周期内甘草不同器官总黄酮含量变化来看，叶中总黄酮含量远高于茎。与盐胁迫对照相比，加入不同浓度硅使7、9月份甘草茎中总黄酮含量明显增加；而硅处理显著增加了9月份甘草叶中总黄酮含量且以0.4 g·kg-1和0.6 g·kg-1硅浓度的作用最为明显。

2.2 硅对盐胁迫下甘草茎、叶中总皂苷积累动态的影响

甘草茎中总皂苷含量在整个采样期呈倒“V”字型变化，先逐渐升高，而后在9月达到最小值；叶中总皂苷含量在整个采样期呈递减趋势，在9月底达到最小值（图4）。从整个采样期甘草茎、叶总皂苷含量变化来看，叶中总皂苷含量明显高于茎。与盐胁迫对照相比，0.6 g·kg-1硅处理显著增加了7、9月份甘草茎中总皂苷含量却显著降低了8月份甘草茎中总皂苷含量。而加入不同浓度硅使8、9月份甘草叶中总皂苷含量明显增加；只有0.6 g·kg-1硅处理显著增加了7月份甘草叶中总皂苷含量而0.2 g·kg-1、0.4 g·kg-1硅处理使甘草叶中总皂苷含量明显降低。

图3 硅对盐胁迫下甘草茎、叶中总黄酮积累动态的影响

图4 硅对盐胁迫下甘草茎、叶中总皂苷积累动态的影响

3 讨论

药用植物的有效成分在其体内的合成与积累是其自身与一定的生长环境长期选择的结果，外界环境在很大程度上影响着药材的产量、质量，且对不同时期[12]、不同部位[5]的影响效应不同。而甘草的生长区以盐渍化土壤为主，因此，盐胁迫成为了影响甘草生长和有效成分积累[13]的一个重要的因素。研究表明，外源硅可以影响药用植物在盐胁迫条件下的次生代谢[14]，从而影响其活性成分的含量。由于甘草药材中含有多种有效成分，不同浓度外源硅对盐胁迫下不同部位、不同时期、不同有效成分的影响可能也不尽相同。

本研究发现外源硅能够在一定程度上提高盐胁迫下甘草茎、叶中总黄酮、总皂苷含量且这种提高效应因硅浓度、胁迫时间和不同部位而异。与盐胁迫对照相比，加硅处理明显提高了7、9月份甘草茎、叶中总黄酮含量（图3），且以0.4 g·kg-1和0.6 g·kg-1硅的作用最为明显。与盐胁迫对照相比，0.6 g·kg-1硅处理显著增加了7、9月份甘草茎中总皂苷含量和7、8、9月份甘草叶中总皂苷含量（图4）。由此可见，0.6 g/kg硅对盐胁迫下甘草7、9月份茎、叶中总黄酮、总皂苷积累的促进效应最为显著。这可能是由于硅能进一步提高7月份甘草叶片的光合能力，促进其初生代谢和次生代谢，从而在甘草茎、叶中产生并积累了较多的黄酮类、皂苷类成分。而到8月份，随着气温的降低甘草生长减缓[5]，此时期甘草本身已经在茎、叶部位积累了较多的黄酮类、皂苷类成分，使茎、叶中的总黄酮、总皂苷含量达到较大值，此时硅的效益相对较弱。而到了9月份，甘草的叶片开始脱落、地上茎逐渐干枯，地上部分的总皂苷含量降到了全年的最低点，可能与更多皂苷类物质通过茎的运输到了地下部贮存，进而导致茎、叶中含量降低有关[15]；而甘草茎、叶中总黄酮积累趋势却在9月份略有上升，说明次生代谢产物之间可能有物质相互转化的关系[15]。外源硅的加入在一定程度上提高了9月甘草茎、叶中总黄酮、总皂苷含量。

本研究表明，在整个生长期，甘草叶是总黄酮、总皂苷含量最高的器官，茎中有效成分的含量相对较少。甘草作为多年生草本植物，每年可获得大量茎叶资源。然而，目前甘草茎、叶多作为牧草使用，其综合利用率低下。本研究认为，以外源硅提高不同时期甘草茎、叶总黄酮、总皂苷含量为基础，在不影响根中药效成分积累的前提下，选择适宜季节、根据不同需要、结合产地的地域和气候特点采收，从而实现对甘草茎、叶药用资源的有效开发利用。具体而言，7月是甘草的旺盛生长期，人工栽培的甘草可以通过夏季修剪（剪秧）调整植株长势，一方面可以获得一部分茎叶资源，另一方面可以改善通风透光条件，提高叶片光合作用也利于光合产物积累，集中营养，提高药材的产量和质量；9月可以结合甘草药材采收，可将地上部分茎、叶资源进行深度开发利用，进行活性成分提取，从中寻找可替代根部所含有效成分或前体化合物，对其进行加工、改造，使甘草地上资源得到更合理更深入的开发和应用。这不仅可使甘草资源得到充分利用，提高药农种植甘草的积极性，又具有很高的经济效益、社会效益和生态效益。