异迷迭香酸苷介导乳腺癌细胞凋亡的作用及机制

吴元肇，曾 勇，郑克思，吴林斌

乳腺癌数量占女性肿瘤的29%，致死率高达15%[1]。中国地区每年新发乳腺癌人口占比上升显著，城市发病率高于农村地区，且出现年轻化发展势态。目前临床治疗主要以化疗、放疗为主，虽可有效改善生存时间与生活质量，但其死亡率在众多癌症中仍高居不下[2]。传统中药具有历史悠久、疗效优及毒副弱等优势，在肿瘤治疗方面取得了明显进展[3-4]。夏枯草( prunella vulgaris labiatae)属唇形科植物夏枯草的干燥果穗，具有清肝泻火、明目、软坚散结等功效，常用于目赤肿痛、肉痛眩晕、乳痈或乳癖等治疗[5]。已有临床观察与实验研究表明，夏枯草具有良好的抗肿瘤活性[6-7]。异迷迭香酸苷是夏枯草中重要的酚酸类化合物，具有良好的抗氧化活性[8]，但异迷迭香酸苷作为重要的潜在质控成分[9]是否参与夏枯草抗乳腺癌作用尚不清楚。本实验拟围绕抗增殖、促凋亡等途径，从分子水平考察异迷迭香酸苷干预乳腺癌的作用与机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 异迷迭香酸苷（Y-089-161230），成都瑞芬思生物科技有限公司提供；胎牛血清，购自美国Gemini公司；MTT、二甲亚砜，购自美国Sigma Aldrich公司；AO/EB试剂盒与BCA蛋白定量试剂盒，购自南京碧云天生物技术研究所；ECL化学发光液，购自美国GE公司；细胞内葡萄糖调节蛋白(glucoseregulated protein, GRP78)、转录激活因子(activating transcription factor 4, ATF4)、C/EBP 同源蛋白 (C/EBP-homologous protein, CHOP)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein, Bax)、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、真核生物翻译起始因子2α(Eukaryotic translation initiation factor 2 alpha,eIF2α)、p-eIF2α、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(caspase3)、c-caspase3、B细胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma 2, Bcl2)抗体，购自美国CST公司；β-Tubulin、二抗，购自南京巴傲得生物科技有限公司；其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 细胞培养与传代 人乳腺癌细胞株 MDAMB-231，购自上海中科院细胞库。取人乳腺癌细胞，采用RPMI1640（10% FBS+1% P/S）进行重悬，放置在37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养。隔天待细胞贴壁融合，以1：2的比例进行传代。

1.3 MTT法检测细胞增殖率 取对数生长期MDA-MB-231细胞，加入RPMI1640重悬稀释至5×104个/mL接种于96孔培养板，每孔100μL，培养24 h。待细胞贴壁，每孔加入异迷迭香酸苷（0.01、0.1、1μmol/L）进行孵育。继续培养24 h，根据MTT法检测细胞活性。每组设置6复孔，实验重复3次。

1.4 AO/EB法观测细胞凋亡 取对数生长期MDA-MB-231细胞，加入RPMI1640重悬稀释至1×105个/mL接种于含无菌玻片的24孔板。培养24 h，待细胞贴壁，每孔加入异迷迭香酸苷（0.01、0.1、1 μmol/L）进行孵育。继续培养24 h，取出玻片并覆盖AO/EB 混合液4μL，置荧光显微镜下进行形态学观察。每组设置3复孔，实验重复3次。

1.5 Western blotting检测 内质网应激通路及凋亡相关蛋白表达 取对数生长期MDA-MB-231细胞接种于6孔板内，加入不同浓度异迷迭香酸苷进行干预。处理后收集细胞裂解液，进行BCA蛋白定量，SDS-PAGE凝胶电泳、转膜。浸于5%BSA封闭，分别用GRP78、ATF4、CHOP、Bax、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、caspase3、c-caspase3及Bcl2一抗过夜孵育（1:2000，4℃）。次日漂洗，加入二抗孵育30min（1:5000，常温）。再漂洗，ECL化学发光、显影。ImageQuant软件扫描并分析相应灰度值，检测需重复3次。

1.6 统计学分析 运用 SPSS17.0 统计软件对数据进行分析，计量资料先采用Shapiro-Wilk检验判断数据是否为正态分布，所有数据均呈正态分布且方差齐性，以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异迷迭香酸苷对乳腺癌细胞增殖的影响 检测细胞增殖率发现，与空白对照组（100.00±7.69）%比较，异迷迭香酸苷0.1μmol/L组（81.56±6.76）%、1μmol/L组（69.33±6.40）%及10 μmol/L组（44.54±7.37）%细胞增殖率均得到有效抑制（P＜0.05，P＜0.01）。在各给药组中，以10 μmol/L异迷迭香酸苷作用最强。见图1。

图1 异迷迭香酸苷对MDA-MB-231增殖率的影响（, n=6）

图2 异迷迭香酸苷对MDA-MB-231凋亡的影响（, n=3）

2.2 异迷迭香酸苷对乳腺癌细胞凋亡的影响 AO/EB法观察结果表明，异迷迭香酸苷干预可明显促进细胞凋亡。计算凋亡率发现，异迷迭香酸苷0.1μmol/L组（155.67±14.38）%、1μmol/L组（183.14±15.18）% 及 10μmol/L组（224.52±17.26）%，与空白对照组（100.00±16.54）%比较增加明显。当异迷迭香酸苷浓度为0.1 μmol/L和1 μmol/L时，视野中出现橘黄色荧光，表明细胞受到损伤。当浓度提高至10 μmol/L时，视野中橘黄色荧光更为明显，提示细胞损伤情况严重。由此可知，异迷迭香酸苷可加剧乳腺癌细胞凋亡，且呈浓度依赖性。见图2。2.3 异迷迭香酸苷对乳腺癌细胞中GRP78/CHOP信号通路的调控作用 Western bloting结果显示，异迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，GRP78 表达量分别为（1.78±0.16）、（1.83±0.27）、（2.52±0.25），较空白对照组（1.00±0.12）增加（P＜0.05，P＜0.01）；异迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，ATF4表达量分别为（1.67±0.15）、（1.69±0.08）、（2.215±0.29）， 较 空 白 对 照 组（1.00±0.05）增加（P＜0.05，P＜0.01）；异迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，CHOP表 达 量 分 别 为（1.12±0.07）、（1.23±0.07）、（2.06±0.20），较空白对照组（1.00±0.07）增加（P＜0.05，P＜0.01）；异迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，p-PERK表达量分别为（1.14±0.07）、（1.18±0.13）、（1.42±0.10）， 较空白对照组（1.00±0.04）增加（P＜0.05）；异迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，p-eIF2α表 达 量 分 别 为（1.54±0.02）、（1.65±0.12）、（1.67±0.17），较空白对照组（1.00±0.18）增加（P＜0.05，P＜0.01）。由此可知，异迷迭香酸苷可激活GRP78/CHOP信号通路，加剧内质网应激反应。见图3。

图3 异迷迭香酸苷对MDA-MB-231中GRP78/CHOP相关蛋白表达的影响（, n=3）

2.4 异迷迭香酸苷对乳腺癌细胞中凋亡相关蛋白的调控作用 Western bloting结果显示，异迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，c-caspase3表达量分别为（1.30±0.14）、（1.51±0.22）、（2.01±0.18），较空白对照组（1.00±0.17）增加（P＜0.05，P＜0.01）；迷迭香酸苷浓度为0.1、1、10 μmol/L时，Bcl-2/Bax 表达量分别为（0.80±0.06）、（0.74±0.10）、（0.42±0.08），较空白对照组（1.00±0.10）降低（P＜0.05，P＜0.01）。由此可知，不同浓度异迷迭香酸苷均可有效促进乳腺癌细胞的凋亡。见图4。

图4 异迷迭香酸苷对MDA-MB-231中c-caspase3、Bcl-2及Bax表达的影响（, n=3）

3 讨论

乳腺癌属中医“乳岩”范畴。宋代《妇人良方大全》指出：“起初内结小核，或如鳖棋子，不赤不痛……此属肝脾郁怒，气血亏虚”。因此，中医临床常采用疏肝解郁、清热解毒等法则进行治疗[10]。中药夏枯草具有清肝明目、软坚散结等功效[5]，经临床组方后常用于乳腺癌的治疗。其成分主要包含三萜、甾体、黄酮、香豆素和有机酸等[11]，并可通过磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B、丝裂原活化蛋白激酶、核转录因子κB等信号通路发挥抗肿瘤活性[12]。异迷迭香酸苷是夏枯草中重要成分之一，其药理活性有待深入挖掘。本实验拟体外培养人乳腺癌细胞，并给予不同浓度异迷迭香酸苷进行干预，从而探讨该成分如何介导信号传导发挥抗乳腺癌的作用。

细胞凋亡是机体清除异常细胞的关键途径，多数肿瘤的发生与细胞凋亡受阻有关，因此诱导细胞凋亡是治疗肿瘤的重要策略之一[13]。内质网广泛存在真核生物细胞中，是主要的蛋白质合成折叠场所，参与细胞凋亡进程，且该机制不同于死亡受体与线粒体凋亡途径[14-15]。当体内出现低糖、缺氧、钙平衡失调或氧化应激等情况时，均可导致大量未折叠蛋白或错误折叠蛋白积累，继而诱发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），而GRP78作为ERS分子标志物也随之高表达。在长期ERS刺激作用下，PERK与GRP78发生解离并活化，通过激活eIF2α促进ATF4进行转录，最终上调细胞内CHOP的表达水平[16]，这将意味着ERS反应已切入亢进状态。因此，激活GRP78/CHOP信号通路可加剧内质网应激，促进乳腺癌细胞凋亡。本实验结果表明，异迷迭香酸苷可有效增加GRP78、ATF4、CHOP表达，激活PERK、eIF2α。提示异迷迭香酸苷通过激活GRP78/CHOP信号通路，加剧乳腺癌内质网应激反应，促进细胞凋亡，从而发挥其抗乳腺癌作用。CHOP 作为ERS中间信号调控点，参与细胞凋亡调控。以往研究发现，CHOP可减少Bcl-2表达，使Bax从从胞浆向线粒体易位，继而加剧caspase3的活化过程[17-18]。caspase-3处于蛋白酶级联反应的核心位置，可通过水解多种负责细胞生化和形态学改变的底物，最终导致细胞凋亡、损伤[19]。本实验结果提示，异迷迭香酸苷可明显促进Bax、c-caspase3表达，减少细胞内Bcl2水平，加速乳腺癌细胞凋亡，并可有效抑制其生长活力。

异迷迭香酸苷可通过激活GRP78/CHOP信号通路，加剧内质网应激反应，促进乳腺癌细胞凋亡，从而发挥其抗乳腺癌活性。本实验研究为乳腺癌的治疗提供了潜在策略，同时为中药夏枯草抗乳腺癌的临床应用补充科学依据。