基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术在尿标本微生物快速鉴定中的应用*

许荣琴，杜 鸿，谢小芳，郭 敏，周惠琴△

(1.苏州市第七人民医院检验科,苏州 215151；2.苏州大学附属第二医院检验科,苏州 215004)

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术是近年来新兴的细菌鉴定技术，它的出现在微生物实验室掀起了一场病原体鉴定的革命，被认为是鉴定细菌最有效的方法，具有准确快速和成本低等传统方法不可比拟的优势，尤其对于一些微需氧菌、厌氧菌和分枝杆菌的鉴定[1-7]。目前，MALDI-TOF MS技术主要应用于临床各种送检标本分离培养后单菌落的检测，本实验室利用质谱技术直接鉴定血流感染中的病原菌取得了较好的效果，可为临床血流感染的及时诊治提供有效可行的实验室检测手段[8-9]。而由于其他无菌部位的标本，如尿液、脑脊液等因细胞或蛋白干扰，质谱直接检测受到限制。目前临床诊断尿路感染除了结合临床表现，主要依靠传统的尿培养及尿常规和尿液有形成分分析，尿培养细菌鉴定耗时长，尿常规和有形成分分析通常是作为快速筛查试验。为了能够快速准确地对中段尿进行细菌鉴定，本文对MALDI-TOF MS技术在尿液标本微生物快速鉴定中的应用价值进行评估，现报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集2016年10-12月苏州大学附属第二医院住院和门诊送检的清洁中段尿标本。

1.2仪器与试剂 采用无菌生理盐水、哥伦比亚血琼脂平板、甲酸、CHCCA基质液、KDC-40低速离心机、SIGMA高速离心机、MALDI BioTyper质谱仪(德国布鲁克公司)、PhoenixTM-100自动化微生物鉴定仪、AUTION MAX AX-4280尿常规分析仪、UF-1000i全自动尿有形成分分析仪等。

1.3方法

1.3.1标本前处理 中段尿标本混匀后取6 mL于无菌试管中，3 000 r/min离心10 min，弃上清液，加1 mL无菌生理盐水，混匀后500 r/min离心5 min，吸上清液于无菌EP管中以5 000 r/min离心5 min，弃上清液留沉淀待用。

1.3.2质谱检测 将EP管中沉淀混匀成悬液，取1 μL均匀涂布于MS靶板，干燥后取1 μL甲酸覆盖，再干燥后取1 μL基质液覆盖，最后干燥后经MALDI BioTyper质谱仪检测，记录结果。

1.3.3革兰染色镜检 将EP管中剩余沉淀混匀，取适量涂片革兰染色镜检，观察镜下细菌浓度及杂质情况并记录。

1.3.4尿常规和尿液有形成分分析 将尿标本采用AUTION MAX AX-4280尿常规分析仪及UF-1000i全自动尿有形成分分析仪进行尿常规和有形成分分析，并记录结果。

1.3.5标本培养与鉴定 取10 μL尿标本于血琼脂平板上连续划线，置35 ℃、5%CO2孵箱中过夜培养，取培养阳性标本的菌落经PhoenixTM-100自动化微生物鉴定仪鉴定，鉴定仪无法鉴定的则取单菌落进行质谱鉴定，记录结果。将直接质谱鉴定结果与培养结果进行比较，以培养结果为标准，计算直接质谱法的鉴定率。

2 结 果

2.1传统尿培养与直接质谱检测与尿常规和尿有形成分分析结果比较 所有标本中培养阳性212例，培养出一种菌的标本201例，直接质谱鉴定率为78.6%，其中大肠埃希菌检出率最高，为92.0%，培养出两种菌的标本11例，直接质谱鉴定率为90.9%,但只有2例直接质谱鉴定出两种菌，8例只鉴定出其中比例较大的细菌，另外有2例标本培养结果分别为副流感嗜血杆菌和阴道加德纳菌，而直接质谱鉴定结果相应为大肠埃希菌和普通变形杆菌，这与传统培养结果不符，直接质谱鉴定率记为0.0%，见表1。

表1 传统尿培养、直接质谱检测与尿常规和尿有形成分分析结果比较

2.2标本菌落数对应鉴定率统计结果 见表2。除11例培养出两种菌的标本及1例副流感嗜血杆菌和1例阴道加德纳菌外，其他7种类别均显示规律性。即标本的菌量越多则直接质谱鉴定率越高，对于最常引起尿路感染的大肠埃希菌和肠球菌属，若菌落计数>105CFU/mL，则质谱鉴定率高达97.6%以上。

表2 标本菌落计数对应鉴定率统计

2.3质谱中不同鉴定分值含义 0.000～1.699没有可信的鉴定结果，>1.699～1.999鉴定到属的水平，>1.999～2.299鉴定到种的水平，>2.999～3.000完全可靠地鉴定到种的水平。本研究各种细菌质谱分值分布见表3。对于大肠埃希菌，除了2例培养结果为大肠埃希菌而直接质谱分别鉴定为阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌以外，当直接质谱分值≥1.5时就已经和传统培养结果一致，说明对于大肠埃希菌直接质谱鉴定分值≥1.5时可信度已经较高，由此可见尿液直接质谱鉴定对大肠埃希菌的鉴定尤为可靠，其次为其他肠杆菌科和肠球菌属，质谱分值≥1.7的比例分别为77.8%、57.9%。此外，11例混合感染标本中质谱鉴定出10例，鉴定率达90.9%，但是仅2例两种菌均鉴定出，且质谱结果分值均小于1.7，可信度不高，其他8例则是菌种所占比例较高的被鉴定出，质谱结果分值≥1.7的比例为87.5%，其中如若菌种所占比例相同，则肠杆菌科细菌和肠球菌属优先被检出，非发酵菌科如铜绿假单胞菌则不能被检出。

表3 质谱鉴定结果准确性统计

3 讨 论

比较尿常规和有形成分分析结果发现，亚硝酸盐、白细胞酯酶、细菌三者总体阳性率均不及MALDI-TOF MS的鉴定率，由此可见MALDI-TOF MS鉴定的优势，快速、准确率又高。鉴定出的大肠埃希菌和其他肠杆菌科细菌与亚硝酸盐、白细胞酯酶、细菌这三者有一定相关性，符合率达70.6%～84.0%，准确性较高，因此，尿常规和有形成分分析可以作为辅助检测手段共同服务于临床，其他菌属和假丝酵母菌属数量少，阳性率不高，不可信。

在MALDI-TOF MS检测的同时对差速离心获取的沉淀进行革兰染色镜检发现，差速离心法并不能完全保证病原菌与细胞和杂蛋白等彻底分离，带有杂质的标本悬液可能造成质谱分值降低，鉴定不出或菌种错判。目前临床引起尿路感染的病原菌相对比较单一，以大肠埃希菌和肠球菌属为主，而采用MALDI-TOF MS技术快速鉴定尿标本中的微生物时大肠埃希菌鉴定率高达92.0%，体现了较高的临床应用价值[10-11]。此外，可通过增加差速离心次数和甲酸乙腈萃取步骤，结合革兰染色涂片镜检及尿常规和有形成分中亚硝酸盐、白细胞酯酶、细菌等其他辅助手段来提高鉴定率，以实现MALDI-TOF MS技术快速鉴定尿液中微生物的临床应用。

本研究发现，除11例培养出两种菌的标本，以及1例副流感嗜血杆菌和1例阴道加德纳菌外，其他7种菌种类别均显示出规律性：即标本的菌量越多则MALDI-TOF MS鉴定率越高。分析原因可能是：菌量多很大程度上消除了标本制备过程中病原体丢失的影响，且缓冲了杂质干扰，对于MALDI-TOF MS未检出且涂片菌量少、杂质多的标本，可重复提纯处理或增加差速离心的标本量，或尝试通过其他检测手段给出鉴定结果。另外2例培养结果分别为副流感嗜血杆菌和阴道加德纳菌的标本MALDI-TOF MS鉴定结果相应为大肠埃希菌和普通变形杆菌，二者差别很大，本研究在沉渣革兰染色时发现这2例标本杂质均较多，分析原因可能是其本身菌体形态的特殊性，均是革兰阴性小杆菌，菌体小，不易与杂质分离，从而导致MALDI-TOF MS无法鉴定或误判。

在质谱法中，MS分值为可信程度分值小于1.7表示鉴定结果不可靠，分值大于或等于1.7表示鉴定结果可信。本研究发现，大肠埃希菌不仅鉴定率较高，且MS分值大于或等于1.5的时候鉴定结果已与培养结果一致，体现了较高的鉴定率和准确率，其次是其他肠杆菌科细菌和肠球菌属。非发酵菌科、链球菌属、假丝酵母菌属和其他革兰阳性菌的MS分值绝大部分小于1.7，且部分结果与培养结果存在差异，可信度降低，由此可见，混合感染方面质谱直接检测尿标本存在欠缺，大部分情况下只能鉴定出比例较高的菌种。 本研究在沉渣镜检中发现，非发酵菌比如铜绿假单胞菌镜下涂片不均一，细菌大多聚集成团，可能跟其鞭毛结构有关，涂靶板时不易均匀散开，从而影响质谱的鉴定，同样的情况在肠杆菌科中的变形杆菌属也有体现。

综上所述，与传统尿培养比较，采用中段尿差速离心后的沉淀经MALDI-TOF MS技术直接鉴定的方法具有简单快速、成本低、准确率高等优点，结合其他辅助方法(如尿常规和有形成分分析等手段)，可极大提高MALDI-TOF MS技术快速鉴定尿标本微生物的临床应用价值。另外，MALDI-TOF MS技术也在不断发展和完善，比如扩大标准质谱图库，研究开发耐药性检测模式[12-14]，应用质谱技术直接检测尿标本有不容小觑的应用前景，还需要不断探索和完善。