两种仪器定量检测HIV-1病毒载量比较研究*

李丽华，余婷婷，丁彩梅，张润武，杨冬梅 ，王红英， 白 经 ，普 冬

(云南省昆明市第三人民医院检验科 650041)

随着艾滋病(AIDS)防治工作的不断强化，AIDS实验室检测技术也在不断发展，根据《艾滋病资料手册》规定[1]，接受治疗的AIDS患者必须定期检测病毒载量，人类免疫缺陷病毒(HIV)载量检测被认为是目前预示疾病演变、提示开始临床治疗和评估疗效的有效指征[2]。同时HIV病毒载量检测还可作为灵敏的HIV早期感染的诊断方法[3-4]，特别是对HIV阳性产妇的婴儿和处于HIV抗体窗口期的感染者等特殊免疫性个体具有较好的提示作用[5-6]。核酸高精度定量检测仪是获得准确临床实验室结果的关键因素，减少了核酸手工提取中容易出现的操作失误，增加了核酸提取的一致性和重复性[7]。当前常用的核酸高精度定量检测技术包括雅培m2000全自动分析系统、罗氏AmpliPrep/TaqMan全自动分析仪、梅里埃Nuclisens EasyQ HIV-1及西门子公司的Versant HIV-1。国内已有关于几种检测技术的相关研究[8]，但同时对雅培m2000全自动分析系统和罗氏AmpliPrep/TaqMan全自动分析仪进行HIV-1病毒载量定量检测的研究鲜见报道。本研究通过采用雅培m2000全自动分析系统和罗氏AmpliPrep/TaqMan全自动分析仪高精度定量检测方法，对30例HIV-1病毒载量结果不同患者标本进行检测比较，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究涉及的标本为2017年1-6月到本院就诊的，免疫印迹法HIV-1确证试验结果为阳性的AIDS患者标本30例。所选取患者的HIV-1病毒载量从0～105copy/mL均有覆盖。

1.2标本采集 采集患者血液后立即放入有乙二胺四乙酸三钾试管中，充分混匀。然后将全血在4 h内离心并分离血浆，存放于-70 ℃冰箱内，以备检测HIV-1病毒载量使用。

1.3仪器与试剂 采用雅培m2000全自动分析系统、Abbott RealTime HIV-1 Kit检测试剂盒及罗氏AmpliPrep/TaqMan全自动分析系统、罗氏AmpliPrep/TaqMan HIV-1 Test V2.0试剂盒同时进行检测。所有检测试剂盒均在有效期内，操作严格按照试剂盒和仪器说明书进行。

1.4方法

1.4.1雅培m2000全自动分析系统检测方法 Abbott m2000sp系统采用多种操作方法从血浆标本中纯化核酸，采用Abbott内部研发的化学试剂，以未包被的氧化铁磁珠作为捕获介质从0.6 min血浆或血清标本中提取RNA，m2000sp将磁珠、细胞裂解缓冲液和患者标本混合，将标本在50 ℃细胞裂解缓冲液中孵育20 min，细胞裂解缓冲液裂解细胞并释放出RNA，RNA被吸附到磁珠上，通过优化磁铁吸附过程在单管中进行磁珠捕获，清洗磁珠以便除去未结合的血浆或血清标本组分，重复捕获和清洗过程，从而除去其他多余的标本组分、污染物和抑制剂，然后在75 ℃低水平磷酸盐缓冲液中孵育20 min，从磁珠上洗脱获得RNA，加水孵育，将缓冲液稀释至极低水平，磁珠被磁铁吸附，核酸被转移到96深孔板中，获得聚合酶链反应(PCR)反应板，密封并装入Abbott m2000rt进行实时PCR检测。

1.4.2罗氏AmpliPrep/TaqMan全自动分析仪检测方法 AmpliPrep/TaqMan仪器可自动制备标本。该程序可以处理850 μL血浆标本。在稍高的温度下，蛋白酶和裂解液/结合缓冲液与标本孵育，裂解HIV-1病毒颗粒，释放出核酸，并保护HIV-1 RNA免受血浆中RNA酶的破坏。蛋白酶和已知拷贝数的HIV-1定量标准物QS带盔甲RNA与裂解试剂和磁性玻璃珠一起加入到每一份标本中。混合物经孵育后，HIV-1 RNA和HIV-1 QS RNA结合于磁性玻璃珠表面。未结合的一些物质，如盐、蛋白质及其他细胞杂质经洗涤磁性玻璃珠后被除去。经磁性玻璃珠分离和完全洗涤步骤，吸附的核酸在较高温度下洗脱下来。样品处理后释放出来的HIV-1 RNA及HIV-1 QS RNA被加入至扩增混合物中，并被转移至COBAS TaqMan分析仪，HIV-1靶RNA及HIV-1 QS RNA随之进行反转录、扩增，并经切除靶特异的和QS特异的双标记寡核苷酸探针完成实时定量检测。

1.5统计学处理 采用SPSS20.0软件包进行数据处理，并进行绘图和比较分析，两组间计量资料采用配对t检验,相关分析采用Pearson分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两种仪器检测HIV-1病毒载量与外周血CD4+T细胞数及CD4+/CD8+结果 见表1。30例患者HIV-1病毒载量检测结果显示，雅培m2000全自动分析系统阳性检出率为100%，检测结果均值为(2.990±0.284)log copy/mL；罗氏AmpliPrep/TaqMan全自动分析仪阳性检出率也为100%，检测结果均值为(3.100±0.244)log copy/mL，差异均无统计学意义(t=1.466,P>0.05)。

表1 两种仪器检测HIV-1病毒载量与外周血CD4+T细胞数及CD4+/CD8+结果

续表1 两种仪器检测HIV-1病毒载量与外周血CD4+T细胞数及CD4+/CD8+结果

2.2两种仪器检测HIV-1病毒载量与外周血CD4+T细胞数及CD4+/CD8+的相关性 见表2。相关性分析结果显示，雅培m2000全自动分析系统、罗氏AmpliPrep/TaqMan全自动分析仪HIV-1病毒载量检测结果均与CD4+T细胞数及CD4+/CD8+呈明显直线负相关。

表2 两种仪器检测HIV-1病毒载量与外周血CD4+T细胞数及CD4+/CD8+的相关性

2.3两种仪器测得病毒载量之间的相关性分析 见图1。雅培m2000和罗氏AmpliPrep/TaqMan两种全自动分析系统检测的病毒载量呈线性关系(r=0.968，P<0.001)。

图1 两种仪器测得HIV病毒载量相关性分析

3 讨 论

雅培m2000全自动分析系统和罗氏AmpliPrep/TaqMan全自动分析仪均能够检测所有M组和O组的HIV-1毒株及非B亚型HIV-1的病毒载量，这些检测系统提供了一种既快速又高度准确的检测方法，有助于患者接受最有效的治疗[8]。

雅培m2000和罗氏AmpliPrep/TaqMan两种检测系统在检测原理、方法上都基本相似，均是对HIV-1病毒载量进行定量高精度检测，其检测结果在AIDS抗病毒治疗过程中可作为临床医生制订用药方案的参考指标，确定药物耐受水平，也可为更换治疗方案或对现有方案进行改进做准备。本研究对30例AIDS患者血浆采用雅培m2000全自动分析系统和罗氏AmpliPrep/TaqMan全自动分析仪同时测定病毒载量，所选患者的HIV-1病毒载量从0～105copy/mL均有覆盖，所有标本两种方法阳性检出率均为100%，特异度和重复性、阳性检出率一致，两种方法检测结果差异无统计学意义(P>0.05)，提示两种检测系统均有较高的灵敏度。

HIV载量反映的是HIV在体内复制的数量，CD4+T细胞数指HIV感染靶细胞的数量，预示着人体不同的免疫水平[9]，CD4+T细胞数低下或降低提示患者病情恶化。因此，可通过分析病毒载量和CD4+T细胞数变化来了解抗病毒疗效。本研究结果显示，雅培m2000全自动分析系统和罗氏AmpliPrep/TaqMan全自动分析仪检测的HIV-1病毒载量均与CD4+T细胞数及CD4+/CD8+呈明显负相关，当病毒载量检测值较低时，CD4+T细胞数及CD4+/CD8+一般较高，反之，当病毒载量值升高时，CD4+T细胞数及CD4+/CD8+呈下降趋势，这与路新利等[10]和李玲等[11]的研究结果相一致。

雅培m2000和罗氏AmpliPrep/TaqMan两种检测系统也存在一定的差异。主要表现在：雅培m2000全自动分析系统在操作时可用标本采集原始管直接上机，避免手工混合操作，相对于罗氏AmpliPrep/TaqMan全自动分析仪手工操作标本加载和卸载，消除了交叉污染，同时降低了操作时工作人员易造成的误差。雅培m2000全自动分析系统可开放模式，一次提取，多次应用，便于实时复查，可用于其他如耐药性分析及分型等，大大节约了试验成本。罗氏AmpliPrep/TaqMan全自动分析仪提供了整合的自动化标本制备系统，使整个标本检测过程自动化，提高了操作流程的效率。雅培m2000系统的m2000sp和m2000rt 2个部分是分开的，在安装上就可遵循分子生物实验室的分区理念，而罗氏AmpliPrep和TaqMan两种分析系统是连在一起的，对实验室场地、环境要求相对较高，但操作过程相对易于掌握。

当然，两种全自动分析系统也有各自的不足之处，由于是高精度的定量分析系统，两种分析系统均需使用原装配套试剂及耗材，在带来稳定可靠结果的同时检测成本也相对较高，耗材消耗量较大。但是，随着联合国艾滋病规划署提出“2030年终结艾滋病”愿景的提出，以及2020年实现“3个90%”防治目标，即：90%的感染者通过检测知道自己的感染状况，90%已经诊断的感染者接受抗病毒治疗,90%接受抗病毒治疗的感染者病毒得到抑制，HIV RNA载量的高精度检测将具有重要意义。两种精准的定量分析系统对病情的准确判断，特别是对HIV阳性产妇的婴儿和处于HIV抗体窗口期的感染者等特殊免疫个体[5-6]，在其感染的早期诊断中发挥了重要作用。此外，两种精准的定量分析系统还能指导AIDS抗病毒治疗的疗效监控，以尽量清除病毒或抑制病毒复制[12]。AIDS患者在很大程度上依赖HIV RNA载量的精确测定，因此，只有采用高精度的检测方法才能为临床医生提供更准确可靠的AIDS治疗依据。