氨茶碱对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠炎性因子及T淋巴细胞亚群的影响

郭伟峰 黄 弘 何约明 庄锡彬

(福建医科大学附属泉州第一医院呼吸内科，福建 泉州 362000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是临床常见的呼吸道疾病，主要表现为持续及进行性加重的气流受限及通气功能障碍。COPD实质是一种慢性气道炎症性疾病，炎症细胞浸润刺激大量的炎性介质释放，引起黏液分泌增加，加重炎症反应和气道阻塞症状〔1，2〕，患者常伴免疫功能异常，尤其是细胞免疫功能紊乱。氨茶碱为茶碱与乙二胺的复盐，茶碱可增强膈肌收缩力，乙二胺可增强水溶性，广泛用于COPD急性加重期或稳定期患者的治疗中〔3〕。氨茶碱有抑制炎症反应与调节免疫功能的作用，但具体机制尚不清楚。本文通过动物实验探讨氨茶碱对COPD模型大鼠炎性因子及T细胞亚群的影响，分析氨茶碱对COPD的防治作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠8只，6～8周龄；体质量200～250 g，平均(220.24±20.12)g；购自福建医科大学动物实验中心(许可证号：SCXK20151210)；饲养条件：室温(25.21±1.24)℃，相对湿度50%～60%，常规进食、饮水，适应性饲养1 w后进行试验。

1.2主要材料 氨茶碱片(上海信谊天平药物有限公司，批准文号：国药准字H31021799，规格0.1 g×48片)；辛伐他汀片(国药集团工业有限公司，批准文号：国药准字H20103418，规格20 mg×10片)；脂多糖(LPS，美国Sigma公司)；戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司，批准文号：国药准字H31021724，规格100 mg)；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂(北京晶美生物工程有限公司)。

全自动生化分析仪：日本日立7600型；流式细胞仪：贝克曼库尔特Gallios型；高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂TGL-16型；恒温冰箱：天津泰斯特仪器有限公司HH-W21-60型；光学相差显微镜：日本Olympus公司CKX41型；病理图像分析系统：Germany公司Leica Qwin standard2.8。

1.3动物分组及模型制作 按照随机数字表法将32只大鼠分为对照组、模型组、氨茶碱组和辛伐他汀组各8只。COPD大鼠模型的制备采用气管注射LPS合并熏香烟法〔4〕。除对照组外，其余三组大鼠于第1、14天，用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，将静脉套管针快速插入大鼠气管，注入LPS 200 μg/200 μl，随后将大鼠直立旋转，使LPS均匀分布于两肺。第30～56天(第42天除外)，每日将大鼠置于60 cm×50 cm×40 cm的密封箱内，向密封箱中持续注入香烟烟雾30 min，上、下午各注入1次。

1.4药物干预 除烟熏时间外，所有大鼠在相同环境下饲养。建立大鼠COPD模型后，模型组用生理盐水1 ml/100 g灌胃，1次/d；氨茶碱组用氨茶碱50 mg/kg灌胃，1次/d；辛伐他汀组用辛伐他汀5 mg/kg灌胃，1次/d。对照组用生理盐水1 ml/100 g灌胃，1次/d。大鼠均连续灌胃2个月。

1.5肺组织病理学检查 大鼠心脏采血法致死后，将右肺中下叶置于甲醛溶液中浸泡24 h，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察肺组织病理改变。

1.6炎性因子检测 大鼠心脏采血法致死后，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)6 ml，1 000 r/min离心15 min取上清液，采用ELISA法检测BALF中白细胞介素(IL)-8、IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量。

1.7外周血T淋巴细胞亚群检测 大鼠心脏采血法致死后，采集腹主动脉血4 ml分离血清后，采用流式细胞仪测定各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+，计算CD4+/CD8+值。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件行方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1肺组织病理学改变 对照组大鼠支气管肺组织结构完整，纤毛排列整齐，纤毛间夹杂少量杯状细胞，管壁可见少数散在淋巴细胞。模型组肺组织支气管上皮细胞部分脱落，可见纤毛粘连或坏死，黏膜下层与肌层出现大量炎性细胞浸润，支气管平滑肌、肺泡隔明显增厚，管腔内出现大量中性粒细胞、巨噬细胞与黏液分泌物，可见炎性细胞浸润与毛细血管扩张充血。辛伐他汀组、氨茶碱组肺组织病变明显好转。见图1。

2.2各组炎性因子水平比较 模型组BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量均明显高于对照组(P<0.001)；辛伐他汀组、氨茶碱组BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明显低于模型组(P<0.05)；氨茶碱组BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明显低于辛伐他汀组(P<0.05)，见表1。

图1 各组肺组织病理改变(HE，×100)

组别IL-8(ng/L)IL-17(ng/L)TNF-α(ng/L)T淋巴细胞总数(个)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+对照组338.17±20.5955.82±3.01126.83±8.472 815.34±305.5635.71±2.3910.61±0.563.39±0.20模型组602.86±45.731)90.04±7.121)210.59±11.261)1 742.81±200.782)32.18±2.572)12.49±0.732)2.54±0.262)辛伐他汀组482.79±26.053)79.13±5.463)189.47±6.833)1 938.73±214.653)33.54±2.243)11.73±0.713)2.97±0.283)氨茶碱组457.32±21.743)4)62.35±5.083)4)156.06±8.523)4)2 209.45±220.973)4)34.69±2.383)4)11.02±0.593)4)3.26±0.253)4)F/P值8.695/0.0027.324/0.0089.112/0.0006.345/0.0102.456/0.0285.321/0.0166.132/0.011

与对照组比较：1)P<0.001,2)P<0.05；与模型组比较：3)P<0.05；与辛伐他汀组比较：4)P<0.05

2.3各组外周血T淋巴细胞水平比较 模型组T淋巴细胞总数、CD4+、CD4+/CD8+均明显低于对照组，CD8+高于对照组(P<0.05)；辛伐他汀组、氨茶碱组T淋巴细胞总数、CD4+、CD4+/CD8+比值均明显高于模型组，CD8+明显低于模型组(P<0.05)；氨茶碱组T淋巴细胞总数、CD4+、CD4+/CD8+比值均明显高于辛伐他汀组，CD8+明显低于辛伐他汀组(P<0.05)，见表1。

3 讨 论

COPD是一种以持续气流受限为特征的慢性肺部疾病，与反复烟雾等有害颗粒或气体对肺组织和气道的慢性刺激及由此引起的异常炎性反应有关，已成为一个重要的公共卫生问题〔5〕。近年研究发现，氨茶碱有促进细胞外钙离子内流的作用，同时具有抑制炎症反应与调节免疫的作用，可能与抑制炎性细胞的生成与释放有关〔6〕。在临床实践中，氨茶碱是治疗COPD稳定期及急性加重期的常用药物，诊断、处理和预防全球策略(2013年版)中将茶碱类药物作为二线治疗药物〔7〕。

COPD是一种慢性气道炎症性疾病，炎症反应与疾病进展密切相关，IL-17参与中性粒细胞活化、迁移、聚集；IL-8激活趋化嗜中性粒细胞与T淋巴细胞，促进炎症过程；TNF-α是一种具有调节免疫与炎性反应的细胞因子，无论是动物实验还是临床研究均表明，COPD大鼠或患者BALF中血清IL-17、IL-8、TNF-α含量均明显升高〔8，9〕，本研究也证实了该观点。辛伐他汀可抑制肺部及系统性炎症反应，减轻肺气肿程度，延缓肺功能下降〔10〕。氨茶碱的药理作用主要来自茶碱，茶碱的抗炎作用可能与抑制磷酸二酯酶活性、神经肽的释放、氧自由基等有关〔11〕。本研究结果提示氨茶碱更能有效地抑制COPD模型大鼠炎性因子表达水平，国内外学者也有类似的文献报道〔7，12〕。

T淋巴细胞是人体免疫系统的重要组成部分，具有识别和排除抗原、调节机体免疫应答、参与异常炎症反应的作用。COPD气道炎症可分为两期，初发期侵犯气管上皮和黏膜下层，引起中性粒细胞趋化反应和巨噬细胞吞噬反应；随着疾病继续发展，炎症向纵深扩展，则T淋巴细胞亚群数量之间的平衡遭到破坏，CD8+细胞增多，通过免疫应答引起肺自身抗原-抗体反应，进而引起肺损伤，导致肺气肿的发生〔13〕，T淋巴细胞亚群中CD8+细胞增多是COPD的特征性免疫反应。李建生等〔14〕发现，氨茶碱对COPD稳定期大鼠外周血和肺脏局部T淋巴细胞亚群均具有明显的调节作用，本文研究结果也支持这一观点。

本研究结果表明，氨茶碱有助于缓解COPD模型大鼠炎症状态，改善机体免疫功能。但其作用机制尚未明确，有待于更多的基础研究与临床研究去证实。