三七皂苷Rg1对肺纤维化大鼠信号传导蛋白3和胰岛素样生长因子-1 mRNA 表达的影响

黄 锋 贾岩龙 邵焕霞 詹合琴 孙 娟 刘会茹 牛 倩

(新乡医学院药学院，河南 新乡 453003)

肺纤维化(PF)是由多种原因引起的弥漫性肺部疾病的最终结果，该病的主要特征是成纤维细胞的过度增殖与细胞外基质(ECM)异常沉积〔1，2〕。PF临床症状主要是缺氧、进行性的呼吸困难、干咳、酸中毒和呼吸衰竭〔3〕。该病确诊后平均可存活为2～5年，一般年龄越大发病率越高，发病原因可能与遗传、环境污染、药物(如百草枯)、免疫力异常、二氧化硅等因素相关〔4,5〕。尽管PF的发病机制不明，但目前比较认同的一个基本机制为：各种不良因素刺激引起肺部损伤或炎症，导致肺泡与肺间质中巨噬细胞等其他炎性细胞浸润，导致炎性细胞分泌的细胞因子表达增多，进而促使成纤维细胞分裂、增殖为肌成纤维细胞，致使ECM异常沉积，最终形成PF〔6,7〕。胰岛素样生长因子(IGF)-1作为一个旁分泌成纤维细胞的激活剂在成纤维细胞的激活和PF发生中起着重要的作用〔8，9〕。信号传导蛋白(Smad)3也是PF的重要介导者，其在PF的发生和上皮间质转化过程中起重要调节作用〔10，11〕。三七皂苷Rg1是从云南中药材三七根茎中提取的单体化合物，为三七总皂苷的主要成分之一〔12〕。三七总皂苷在动物模型中具有显著的抗PF作用〔13〕，但其单体成分三七皂苷Rg1对PF保护作用及其对PF组织中Smad3和IGF-1基因表达的影响尚不清楚。本研究探讨博来霉素诱导的PF大鼠采用三七皂苷Rg1治疗后Smad3和 IGF-1 mRNA 表达的变化。

1 材料与方法

1.1药物、试剂和仪器 三七皂苷Rg1由四川成都瑞芬思生物科技有限公司提供，为白色粉末，纯度>98%；博来霉素由日本化药株式会社提供(15 mg/支，产品批号：460430)；羟脯氨酸(Hyp)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；All-in-OneTMFirst strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒、HiScript TM QRT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 购自南京Vazyme 科技公司；Smad3 (GeneCopoeia®,USA,ID:MQP030343)，IGF-1 (GeneCopoeia®,USA,ID:MQP026708)和内参GAPDH(GeneCopoeia®,USA,ID:MQP027158)购于郑州乐睿生物科技有限公司；琼脂糖(批号111760)购于西班牙Biowest公司。其他常规试剂如异丙醇、氯仿和焦碳酸二乙酯(DEPC)等购于上海化学试剂公司。ABI StepOne实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪，美国ABI公司；Nanodrop-2000紫外/可见光分光光度计，美国赛默飞世尔公司；AE240精密分析天平瑞士Mettler公司;MulTISKAN酶标仪,美国Thermo公司；16K-R低温台式离心机，长沙鑫奥仪器仪表有限公司；Hfsafe-1200 生物安全柜，西化仪北京科技有限公司；MDF-U4086S超低温冰箱，日本SANYO公司；DYY-6C电泳仪，北京六一仪器厂。

1.2PF模型的制备 清洁级SD成年雄性大鼠，购于郑州大学动物实验中心(许可证号：SCXK Henan 2010-0001，合格证号：No.0005496)。本项目对动物的处理遵照新乡医学院动物管理委员会和中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。用单一剂量5 mg/kg的博来霉素气管内注射诱导PF模型〔14,15〕。大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)使其麻醉，然后仰卧固定于大鼠解剖台上。大鼠颈部正中皮肤切口2～3 cm,将博来霉素快速注入气管，然后使动物直立并旋转几次，以保证药物能均匀地分散到肺组织。手术区域再次消毒后分层缝合，动物被放回笼中密切观察。假手术组经历同样的手术过程，但气管内滴入生理盐水代替博来霉素。

1.3动物分组和给药 138只清洁级健康雄性SD大鼠，体重(240±10)g，随机分为假手术组、模型组、模型+阳性对照(M+P)组、模型+三七皂苷Rg1低剂量(18 mg/kg)(M+RL)组、模型+中剂量(36 mg/kg)(M+RM)组和模型+高剂量(72 mg/kg)(M+RH)组，共6组，假手术组动物18只，其他各组每组24只。假手术组无死亡，其他各组剔除死亡动物后，模型组14只，阳性对照组、M+RL和M+RM组各18只，M+RH组20只。此实验在动物造模后当天开始给药，每天1次，均采用灌胃给药。假手术组和模型组给予同等体积的生理盐水(5 ml/kg)，M+P组给予醋酸泼尼松(5 mg/kg)，三七皂苷Rg1各剂量组给予相应剂量的三七皂苷Rg1。至连续用药7 d时，处死每一组中的一半动物，剩余的各组动物接着用药至28 d后再处死。每一组中6只动物的肺组织用于qPCR测定，其余动物的肺组织用于测定PF评分和Hyp的含量。

1.4Masson染色和PF评分 大鼠右中肺叶制成5 μm厚石蜡切片。组织切片用Masson三色蓝染色方法进行染色。石蜡切片常规脱蜡后用苏木素染色6 min，Masson复合染色液5 min，5%磷钨酸5 min和2%苯胺蓝液5 min，染色完毕后用高清晰图像分析仪摄像观察。照片中蓝色越多表明PF程度越重，根据肺组织Masson染色情况并参照PF评分标准，进行评分。PF分级：0级：无PF(-)；1级：轻度PF(+)，病变范围局限在全肺20%以下；2级：中度PF()，病变范围占全肺20%～50%；3级：重度PF()，病变范围大于50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱。-为0分，+为1分，为2分，为3分，将等级资料转化为计量资料。

1.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肺组织中Hyp的含量 各组均取右下叶肺组织0.2 g加1.8 ml的冰盐水,离心10 min (-4℃，1 000 r/min),取上清液保存在4℃，考马斯亮蓝对各样品进行蛋白定量。根据标准蛋白的浓度和吸光度值求出Hyp的回归方程和相关系数为Y=0.002 2X-0.106 8，R2=0.949。每个样本Hyp的有色试样吸光度值(OD值)用MulTISKAN酶标仪(Mk3,Thermo,USA)在450 nm波长处测定，然后将样品的OD值代入方程式计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即可得出每一样品所含的Hyp含量，每个样品的OD值越大，其蛋白含量越高。

1.6qPCR技术检测Smad3和IGF-1 mRNA的表达 处死大鼠后，取100 mg的左肺组织在液氮中磨碎。Trizol试剂提取样本中的总RNA，用HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 试剂盒反转录成cDNA。取各样本中1 μl的cDNA用AceQTM qPCR SYBR® Green Master Mix试剂盒执行qRT-PCR过程。PCR反应采用连续检测系统执行。热循环和SYBR绿色荧光被用于qRT-PCR的定量检测。PCR条件为：95℃ 10 min;95℃ 10 s,60℃ 20 s,72℃ 15 s,40个循环。溶解曲线分析被用于执行终止PCR循环后对非特异性PCR产物和引物二聚体的评估。在初始优化运行期间,4倍系列的稀释用于显示每个基因的线性放大范围。阈值循环(Ct)代表PCR循环中一个绿色SYBR荧光的增加高于基线信号可以被首先检测到。根据每组每个样本的Ct值相对定量得出ΔCt，ΔCt对应于目的基因Ct和参考基因Ct之间的差异。最后按F=2-ΔΔCt 计算方法取每组的2-ΔΔCt值检测目的基因与对照基因表达的差异。

1.7统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，方差齐者采用 LSD 方法，方差不齐者采用DunnettT3方法，组内时间点的比较采取t检验。

2 结 果

2.1三七皂苷Rg1对PF大鼠PF评分的影响 模型组PF评分(3.29分)较高，与假手术组(0.28分)差异有统计学意义(P<0.01)；三七皂苷Rg1各剂量组均可降低PF评分(M+RL组1.57分、M+RM组1.43分、M+RH组1.15分)，与模型组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，其低、中、高剂量之间存在剂量依赖性；与M+P组(2.00分)比较，M+RH组作用较好(P<0.05)。见图1。

2.2三七皂苷Rg1对PF大鼠肺组织Hyp含量的影响 给药28 d后，模型组Hyp含量(2.29±0.32)与假手术组(1.61±0.08)比较显著增加(P<0.01)；与模型组比较，M+RL、M+RM、M+RH组呈剂量依赖性地降低Hyp的含量(1.89±0.05、1.66±0.08、1.04±0.18，P<0.05、P<0.01)。M+RM、M+RH组Hyp含量与M+P组(1.92±0.32)相比明显降低(P<0.05)。

图1 各组PF评分比较(Masson染色，×200)

2.3三七皂苷Rg1对PF大鼠Smad3 mRNA表达的影响 给药7 d和28 d后，模型组肺组织Smad3 mRNA表达较假手术组明显增加(P<0.01)；M+P组、M+RL、M+RM、M+RH组可明显降低Smad3 mRNA表达，与模型组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；M+RL、M+RM、M+RH组与M+P组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.4三七皂苷Rg1对PF大鼠IGF-1 mRNA表达的影响 给药7 d和28 d后模型组肺组织IGF-1 mRNA表达显著增加(P<0.05)；与模型组比较，M+RL、M+RM、M+RH、M+P组不同时间点呈剂量依赖性地降低IGF-1 mRNA表达(P<0.05 或P<0.01)；与M+P组比较，M+RH组作用较好(P<0.05)，见表1。

表1 各组给药7、28 d后肺组织Smad3、IGF-1 mRNA表达

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01;与M+P组比较：4)P<0.05

3 讨 论

PF为近年来呼吸系统最严重的疾病之一，起病隐匿且病死率高。目前该病发病机制尚不明确，治疗方法有限。因此，在建立稳定合理的PF模型的基础上研究具有保护作用的药物及其作用机制十分必要。 国内外文献报告中关于制作PF模型的方法有很多种，如用博来霉素、百草枯、放射线及高浓度氧等，其中博来霉素气管内给药因存在方法可靠、操作简单、周期短等〔16〕优点，且博来霉素诱导的动物PF模型与人PF的病理学改变极其相似，所以用博来霉素诱导PF模型是目前公认的经典造模方法〔17〕。

目前认为PF的特点是经早期的肺损伤-肺泡炎到PF这样的一个过程〔15，18〕。本实验结果提示博来霉素诱导PF的典型特征与他人的研究一致〔19〕。Hyp是胶原形成的特征性生物标记之一，在ECM沉积和重构中起重要作用〔20〕。三七皂苷Rg1对PF的病程有减轻和保护作用。

IPF的发生机制通常被认为与转化生长因子(TGF)-β/Smads信号通路的过度激活有关。有研究发现，如果抑制TGF-β依赖性Smads蛋白家族信号转导通路中Smad3的表达，可以预防PF的形成〔21，22〕。IGF-1是TGF-β介导的众多信号传导途径中对于纤维化过程起重要作用的辅助因子。以往研究发现，IGF-1在特发性肺间质纤维化病人肺泡灌洗液的水平较正常人高〔23〕，在博来霉素诱导的PF动物模型的肺泡灌洗液细胞中IGF-1 mRNA表达水平较对照组增强〔24〕。本研究结果提示三七皂苷Rg1对PF的保护作用与其降低Smad3 和IGF-1 mRNA的表达有关。